Клон когда идет: «Клон» — когда смотреть по ТВ — Яндекс.Телепрограмма

Содержание

Клон — Сериалы — Телеканал Ю

Завораживающая, как танец Шахерезады, история отношений Жади и Лукаса. Отношений, в которых встретились два мира – восточный и западный.

Из раскрепощённого Рио-де-Жанейро юная Жади попадает в страну со строгими правилами и нормами морали, прописанными в Коране. Еще вчера девушка гуляла по бразильским пляжам, мечтая влюбится в кого-то особенного, а сегодня она узнает, что по обычаям ее выдадут замуж за незнакомца.

Эта история могла бы так и закончиться, если бы не случайная встреча с бразильцем Лукасом, в которого Жади влюбляется с первого взгляда. Их ждет настоящее чувство, горькое расставание и вера, что когда-нибудь они смогут объединить два полушария своей жизни – восточное и западное.

Факты о сериале:

Телесериал увидел почти весь мир. Он вышел на экраны более чем в 90 странах.

География съемок сериала очень обширна — Бразилия, Марокко и даже пустыня Сахара. Съемки первых серий проходили в пяти городах Марокко: Марракеше, Эрфуде, Эль-Джадиде, Фесе и Уарзазате.

В Сахаре съемочной группе приходилось работать в 50-ти градусную жару! От такой температуры техника выходила из строя, а обувь плавилась. Создателям пришлось приобрести у местных целую партию кожаных сандалий – только они выдерживали такую жару.

Действие последних серий «Клона» также должно было происходить в Сахаре. Но их, вопреки сетованиям режиссера, снимали в Бразилии, подальше от жуткой жары, скорпионов и змей.

Для съемок в Рио-де-Жанейро построили два съемочных города. Первый имитировал средневековый марокканский город, а второй был копией района Сао-Кристовау в Рио — многолюдного и оживленного.

Все актеры, исполнявшие роли восточных жителей, специально освоили марокканские традиции, арабские жесты, мимику, отдельные фразы по-арабски, а также цитаты из Корана.

Готовясь к съемкам, Джованна Антонелли (Жади) в течение месяца обучалась восточным танцам. Но режиссеру этого оказалось мало — по его требованию танцевать научились все актрисы сериала, даже 12-летняя Карла Диас.

Премьера «Клона» почти совпала с терактом 11 сентября в США. Популярность сериала внезапно оказалась под вопросом. Сюжет и герои, подробно представлявшие мусульманский мир могли отпугнуть зрителей. Однако страхи создателей не оправдались — сериал оказался на редкость успешным.

Автором звучащей в сериале музыкальной темы «Urga» является Эдуард Артемьев — знаменитый российский композитор электронной музыки. Оригинальная композиция была создана для фильма «Урга — территория любви». Вокальную партию в ней исполняет Бадема — китайская актриса и певица монгольского происхождения.

«Клон» оказался одним из самых дорогих проектов в истории студии «Глобо». Одни женские восточные украшения обошлись в сотни тысяч долларов!

ФБР отметило «Клон» грамотой за достижения в антинаркотической пропаганде.

телеканал «Ю», премьера, сериал, фильм, анонс, дата, фото, видео, актеры, режиссер, сценарий, подробности

Пользователи Триколора могут смотреть «Ю» и другие телеканалы онлайн

В центре сюжета – завораживающая история любви главных героев, Жади и Лукаса. В этих отношениях столкнулись два мира – восточный и западный. Жади выросла в раскрепощенном, не знающем запретов и стеснения Рио-де-Жанейро. Теперь ей предстоит жить в Марокко – исламской стране. Может, мусульманский уклад жизни в Марокко и не настолько строг, как в других восточных странах, но Жади оказывается в семье, где нужно соблюдать особые правила. Еще вчера девушка гуляла в купальнике по солнечным пляжам Рио и мечтала о большой и страстной любви. Сегодня ей нужно жить по нормам Корана и ждать, пока ее выдадут замуж за незнакомца. Возможно, эта история закончилась бы традиционно и безрадостно, как и тысячи других, ей подобных. Но все меняет случайная встреча с бразильцем Лукасом, в которого Жади влюбляется с первого взгляда. Это настоящее чувство – сильное, всепоглощающее. Расставание будет горьким, но останется надежда на то, что когда-нибудь они смогут быть вместе.

Сериал «Клон» увидел свет в 2001 году и стал чрезвычайно популярным. Он вышел на экраны в более чем 90 странах. Весьма обширной была и география съемок – Бразилия, несколько городов Марокко, даже пустыня Сахара, где приходилось работать в 50-градусную жару! В Бразилии для фильма даже специально построили два съемочных города. Актеры, которые исполняли роли восточных жителей, специально освоили местные жесты и мимику, более того – даже некоторые фразы на арабском и цитаты из Корана.

«Клон» оказался одним из самых дорогих проектов в истории студии Globo. Особенно пришлось потратиться на реквизит – в частности, на восточные украшения, которые обошлись в сотни тысяч долларов.

Создателем сериала выступила Глория Перес, а в главных ролях снялись актеры, чьи имена хорошо знакомы любителям бразильского кино: Джованна Антонелли, Вера Фишер, Мурилу Бенисиу, Даниела Эскобар и другие.

Не пропустите старт легендарного телесериала «Клон» на канале «Ю» 3 сентября. Начало в 19:40

почему к новой соцсети Twibe сразу возникло много вопросов – МБХ медиа

На фоне возможной блокировки твиттера в России тысячи пользователей начали переходить на его новый, российский аналог под названием Twibe. Он представляет собой полную копию популярного сервиса микроблогов, но при этом готов по первому требованию делиться с российскими властями информацией о пользователях. О том, что известно о Twibe и почему многие не доверяют появившемуся из ниоткуда «твиттеру для россиян» — в материале «МБХ медиа».

«Запасной аэродром»

«Аналог твиттера, который не тормозит» — так свое детище позиционируют сами создатели Twibe. Новую платформу, которая практически ничем не отличается от старой, в соцсетях начали активно обсуждать в середине этой недели. «Оригинальный твиттер замедлили и многие не могут им пользоваться в полной мере. Мы хотим чтобы люди не теряли привычное место общения и продолжали писать записи как и раньше», — гласит сообщение на главной странице Twibe.

Появление нового соцсети действительно совпало по времени с усилением давления на оригинальный Twitter: на днях Роскомнадзор пригрозил заблокировать сервис микроблогов, если оттуда не будет удален контент, который российские власти относят к разряду запрещенного (в том числе речь почему-то идет и об аккаунте «МБХ медиа»). Кроме того, на прошлой неделе ведомство также объявило о замедлении работы твиттера в России и даже, с переменным успехом, попыталось воплотить свои угрозы в реальность.

17 марта в твиттере стали призывать регистрироваться в новой соцсети, созданной всего двумя днями ранее. Сразу несколько пользователей рассказали, что решили завести аккаунт в качестве «запасного аэродрома» на случай блокировки попавшего в опалу оригинального твиттера.

Доброе утро.
Вчера случайно попала в twibe,зарегистрировалась.Понравилось.Слов можно писать 10000,картинки видно хорошо и,главное,видео не надо обрезать.В остальном — полная аналогия с твиттером.Мне нравится.Переходите,подписывайтесь,чтобы не потеряться и продолжать общение. pic.twitter.com/lD9w3ET1RC
— ✯ Матрёшка ♥☭ (@Matryoshka_Ru) March 18, 2021

Выглядит Twibe почти в точности так же, как и Twitter — вплоть до расположения панелей и кнопок, а также идентичных шрифтов. Создатели российской соцсети даже скопировали из твиттера «флиты» — аналог сторис из инстаграма; в Twibe они получили название «свифты». Главное отличие отечественной соцсети от американской — в Twibe можно публиковать посты длиной до 10 тысяч знаков, в твиттере максимум — 280 символов. Также у двух сервисов существенно различается политика конфиденциальности: в пользовательском соглашении Twibe прямо говорится о готовности администрации «предоставлять всю доступную информацию… уполномоченным на то органам государственной власти в случаях, установленных законом». Это предсказуемо вызвало негативную реакцию пользователей.

2. (1) рекламная информация? простите, у меня вопросы, правда.
(2) ваши данные могут просто слить (вспомним историю со сроками за картинки).
(3) хз, за свою жизнь я прочитала много пользовательских соглашений, и вот это соглашение не выглядит как документ.
>> pic.twitter.com/s9jjJbWnQW
— зимняя котя🧷 (@_winter_cat_) March 17, 2021

Вопросы к Twibe

Призывов регистрироваться в Twibe в оригинальном Twitter поначалу было довольно много, однако очень скоро их сменило такое же количество предупреждений о том, что делать этого ни в коем случае не стоит. Голоса тех, кто отнесся к Twibe с недоверием, оказались гораздо громче.

Непонятного в новой соцсети действительно хватает. Например, обратили внимание скептики, электронная почта службы поддержки сайта находится на общедоступном домене mail.ru. Сам адрес — [email protected]. Название Beon.vip носит сервис блогов, скопированный с закрытой в 2019 платформы beon.ru, которая была популярна еще в нулевые. Из этого некоторые пользователи сделали вывод, что за созданием Twibe стоят те же люди, которые раньше по аналогичной схеме сделали клон beon. Кроме того, пользователи твиттера обратили внимание, что Twibe имеет хостинг на одном сервере с сайтом, в адресе которого есть слово «porno». Среди других странностей, о которых докладывали пользователи — невозможность удалить свою страницу. Соответствующая кнопка в Twibe была, но до недавнего времени не работала.

Также беспокойство вызывает у пользователей вызывает процесс верификации в российской соцсети. Для того, чтобы получить «синюю галочку» (подтверждение личности) рядом с именем своего аккаунта, поначалу нужно было отправить администраторам Twibe фотографию своего паспорта. Однако затем выяснилось, что в некоторых случаях этот знак отличия дают просто по просьбе пользователя, без предоставления документов. И, кажется, так продолжается и сейчас — на момент выхода материала одним из самых популярных хештегов в Twibe остается #админдайгалочку.

Именно простая и слабая верификация, граничащая с полным ее отсутствием, может быть одной из причин наплыва пользователей: дело в том, что в твиттере галочку выдавали только знаменитостям и популярным блогерам с большим количеством подписчиков. В Twibe аналогичный знак может получить любой.

Не слишком избирательный подход к верификации аккаунтов привел к тому, что в Twibe уже появились подтвержденные аккаунты знаменитостей, которые там, очевидно, не регистрировались. В их числе — российский президент Владимир Путин, оппозиционер Алексей Навальный и основатель компании SpaceX Илон Маск. Сейчас эти аккаунты уже удалены.

На момент опубликования материала администраторы Twibe не смогли ответить на вопросы «МБХ медиа» о принципах работы их сервиса.

Между тем, эксперты не уверены, что новая соцсеть будет пользоваться спросом. Дело даже не вопросах безопасности, а в том, что речь идет о клоне уже существующей площадки, отметил в беседе с «МБХ медиа» медиаэксперт Михаил Гуревич. «Обычно “в лоб” альтернативы не срабатывают. Нужны качественные возможности, которые привлекли бы аудиторию и заставили бы ее перейти с одной платформы на другую. Твиттер ценен не только технологиями, но в первую очередь аудиторией, которая там есть». По его словам, российский пользователь «любит качество, очень ценит аудиторию и использует социальные платформы прежде всего как трибуну». А такой площадкой Twibe, кажется, вовсе не собирается становиться.

19 марта Twibe перестал работать. При попытке открыть сайт в браузере Google Chrome появляется сообщение «Не удается получить доступ к сайту».

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Тендер 0102200001620002494: Поставка расходных материалов и изделий медицинского назначения

Позиция	Кол-во	Ед. изм.	Цена	Сумма	Доля
1. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD45, Общий Лейкоцитарный Антиген, Клон 2B11 + PD7/26	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
2. Антитела моноклональные кроличьи к человеческим CD5, Клон SP19	1	упак	28 840,67 ₽	28 840,67 ₽	1,18%
3. Раствор для восстановления антигена, высокий pH, Концентрированный х50	5	упак	52 980,67 ₽	264 903,35 ₽	10,82%
4. Антитела моноклональные мышиные к гликофорину. Клон JC159	1	упак	29 415,33 ₽	29 415,33 ₽	1,20%
5. Антитела моноклональные мышиные к Десмину, клон D33	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
6. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Меланосома, клон HMB-45	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
7. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Гладко-Мышечный Актин, клон 1A4	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
8. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD10, клон 56C6	1	упак	34 657,67 ₽	34 657,67 ₽	1,42%
9. Антитела моноклональные мышиные к человеческим MUM1 Протеин, клон MUM1p	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
10. Антитела поликлональные кроличьи к человеческим Миелопероксидаза	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
11. Антитела моноклональные мышиные к вирусу Эпштейн-Барра, LMP, клон CS.1-4	1	упак	34 668,67 ₽	34 668,67 ₽	1,42%
12. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD20cy, клон L26	1	упак	17 281,00 ₽	17 281,00 ₽	0,71%
13. Антитела поликлональные кроличьи к CD3	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
14. Флаконы для реактивов к автостейнеру Thermo	1	упак	59 887,33 ₽	59 887,33 ₽	2,45%
15. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Ki-67 Антиген, клон MIB-1	3	упак	36 008,00 ₽	108 024,00 ₽	4,41%
16. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD15, клон Carb-3	1	упак	17 281,00 ₽	17 281,00 ₽	0,71%
17. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD21, клон 1F8	1	упак	34 657,67 ₽	34 657,67 ₽	1,42%
18. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Цитокератин 7, клон OV-TL 12/30	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
19. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Цитокератин 18, клон DC 10	1	упак	34 693,67 ₽	34 693,67 ₽	1,42%
20. Антитела поликлональные кроличьи к человеческим AMACR (P504S), клон 13h5	1	упак	28 851,67 ₽	28 851,67 ₽	1,18%
21. Раствор для восстановления антигена, низкий pH, Концентрированный х50	10	упак	52 980,67 ₽	529 806,70 ₽	21,63%
22. Система детекции с ПХ, Мышиные антитела, Высокий pH	1	упак	307 656,00 ₽	307 656,00 ₽	12,56%
23. Буфер промывочный, Концентрированный х20	4	упак	12 495,67 ₽	49 982,68 ₽	2,04%
24. Антитела моноклональные мышиные к человеческим BCL6 Онкопротеин, клон PG-B6p	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
25. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Рецептор Прогестерона, клон PgR 636	2	упак	46 332,67 ₽	92 665,34 ₽	3,78%
26. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Эстроген Рецептор, Клон 1D5	2	упак	46 332,67 ₽	92 665,34 ₽	3,78%
27. Антитела моноклональные кроличьи к Cyclin D1, Клон SP4	1	упак	28 840,67 ₽	28 840,67 ₽	1,18%
28. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD99, Продукты гена MIC2, Маркер Саркомы Юинга, клон 12E7	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
29. Антитела моноклональные мышиные к человеческим E-Кадгерин, клон NCH-38	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
30. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Цитокератин, Высокий Молекулярный Вес, клон 34?E12	1	упак	23 250,00 ₽	23 250,00 ₽	0,95%
31. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD79?, клон JCB117	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
32. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Эпителиальный Мембранный Антиген, клон E29	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
33. Антитела поликлональные кроличьи к S100	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
34. Антитела моноклональные мышиные к Виментину, клон V9	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
35. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Цитокератин, клон AE1/AE3	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
36. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Цитокератин 5/6, клон D5/16 B4	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
37. Антитела поликлональные кроличьи к Нейрон-Специфичная Енолаза	1	упак	16 025,00 ₽	16 025,00 ₽	0,65%
38. Антитела моноклональные мышиные к человеческим р63, клон 7JUL	1	упак	22 616,00 ₽	22 616,00 ₽	0,92%
39. Антитела моноклональные кроличьи к CD23, Клон SP23	1	упак	28 830,67 ₽	28 830,67 ₽	1,18%
40. Лента клейкая для маркировки предметных стекол	1	упак	48 775,00 ₽	48 775,00 ₽	1,99%
41. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD30, клон Ber-h3	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
42. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD31	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
43. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD34 Class II, клон QBEnd 10	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
44. Антитела моноклональные мышиные к человеческим CD68, клон KP1	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
45. Антитела моноклональные мышиные к человеческим BCL2 Онкопротеин, клон 124	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
46. Антитела моноклональные мышиные к Цитокератину 8. Клон 35?Н11	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
47. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Цитокератин 19, клон RCK108	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
48. Антитела моноклональные мышиные к человеческим Цитокератин 20, клон Ks20.8	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
49. Антитела моноклональные мышиные к человеческим В-Клеточный Специфический Белок-Активатор, клон DAK-Pax5	1	упак	17 274,33 ₽	17 274,33 ₽	0,71%
50. Антитела моноклональные кроличьи к синаптофизину. Клон SP11	1	упак	22 095,33 ₽	22 095,33 ₽	0,90%
51. Антитела моноклональные мышиные к хромогранину. Клон LK2h20	1	упак	36 467,00 ₽	36 467,00 ₽	1,49%
52. Штатив для флаконов к автостейнеру	1	шт	7 241,77 ₽	7 241,77 ₽	0,30%

Партия Зеленского обратилась в МВД из-за «кандидатов-клонов» :: Политика :: РБК

Представители партии президента Украины Владимира Зеленского «Слуга народа» Александр Качура и Вадим Галайчук подали заявление в МВД Украины о незаконном использовании бренда фракции, которое допускают не связанные с ней кандидаты в одномандатных округах. Об этом сообщает «Укринформ».

Речь идет о введении избирателей в заблуждение, что, по словам представителей партии, попадает под ст. 157 УК Украины (воспрепятствование осуществлению избирательного права). Как утверждает Качура, кандидаты, подавая заявление в ЦИК, указывают в документе, что они работают в различных организациях с названием «Слуга народа». Качура уточнил, что насчитал более ста таких компаний, зарегистрированных за два дня до подачи документов. По его мнению, грязная технология с регистрацией «кандидатов-клонов» может быть результатом организованной деятельности.

ЦИК отказалась регистрировать блогера Шария и экс-спикера Рады Литвина

Качура сообщил, что за 25 июня было зарегистрировано от одного до пяти таких кандидатов в одномандатных округах, 26 июня «Слуга народа» начнет подавать заявления в территориальные управления полиции во всех округах, добавил он.

Досрочные парламентские выборы пройдут на Украине 21 июля. О выборах Зеленский объявил после своей инаугурации.

Nissan Tiida – мексиканский клон Megane идет в Россию :: Autonews

Внешне Tiida очень похожа на творения французских дизайнеров, вроде Renault Megane или Peugeot 307, только с более острыми линиями. Платформу этот японец одолжил у брата по цеху Nissan Note. При этом по размерам гномом Nissan Tiida совсем не выглядит: длина – 4205 мм, ширина – 1695 мм, высота – 1535 мм.

Что касается внешней привлекательности, то ничем особенным автомобиль не выделяется. На российский рынок поступят 4- и 5-дверные варианты модели. Хэтчбек не лишен некоторого обаяния и гармонично смотрится как спереди – тут внимание привлекают радиаторная решетка в корпоративном стиле Nissan и вытянутые фары, так и сзади, где достаточно симпатично выглядит сочетание пятой двери и фонарей, заползающих на задние крылья.

А вот седан, в передней части не уступающий 5-дверной версии, разочаровывает дизайном задней части. Мало того, что очень похож на корейские аналоги, так еще и выглядит, как будто от одной машины отрезали багажник и приварили к другой. В целом передняя и задняя части не очень сочетаются друг с другом.

В Японии Tiida очень хорошо оснащена: тут и навигационная система, и камеры заднего вида, и многое-многое другое. Наверняка в России комплектация будет гораздо бедней. Хорошо если в самую простую комплектацию будут включены кондиционер и четыре подушки безопасности, но, может, и этого не будет. Обещают, правда, что внутри автомобиль поразит даже самых требовательных покупателей. Задние сидения, например, могут отодвигаться, для этого приспособлены специальные рельсы длиной 240 мм, а передние сидения, по некоторым данным, будут разворачиваться. Объем багажника может колебаться от 289 до 463 литров.

Что касается линейки двигателей, то для российских покупателей будут доступны автомобили с двумя бензиновыми моторами: объемом 1,6 литра и мощностью 110 л.с. и объемом 1,8 литра мощностью 126 л.с. Один из самых популярных агрегатов объемом 1,5 литра (105 л.с.) в нашу страну поставляться не будет.

Собирается новинка на заводе в Мексике, оттуда и будет ввозиться в Россию. Интересно, что ориентировочная цена на нее определена от 19 000 до 25 000 долларов. В то же время максимальная цена на Almera Classic составляет 18 500 долларов, Note тоже дешевле, даже самый дешевый Qashqai можно приобрести за 21 900 долларов. В общем, непонятно, будет ли новинка пользоваться популярностью в России. Возможно, это станет понятно после оглашения более детальной информации об авто – вероятно, у машины будут еще какие-нибудь достоинства, которые заставят людей выложить за нее такие деньги.

Николай Загвоздкин

git clone fail : речь идет о настройке сертификата

Всякий раз,когда я git clone, это выглядело так.
И теперь я не мог клонировать ничего из github.
Пожалуйста, помогите мне.

git

certificate

setting

Поделиться

Источник

HanYif

29 июня 2016 в 13:05

2 ответа

Как синхронизировать онлайн-ветвь git master
У меня есть машина linux (debian). Мне нужно синхронизировать локальную папку с онлайн-веткой git master. Как это сделать просто и правильно? В настоящее время я запускаю git clone xxx.git ./folder. И каждый раз, когда мне нужно обновление, я удаляю локальную папку и снова запускаю команду clone….
Shell: не подведите git clone, если папка уже существует
Я пишу автоматический сценарий. В какой-то момент я звоню git clone <repo> . Но есть шанс, что эта операция уже сделана. Как я могу вызвать git clone —no-fail так, чтобы он игнорировал, существует ли репозиторий? Спасибо

git config —глобальный http.sslverify «false»

Поделиться

HanYif

30 июня 2016 в 07:47

Вам нужно установить переменную окружения, чтобы разрешить доступ к серверу

Поделиться

Dead End

29 июня 2016 в 13:09

Chromosome Walking — обзор

2. 74EF

Мутации в локусе E74 вызывают летальность на поздних личиночно-предкуколочных стадиях (Burtis, 1985). ДНК, ассоциированная с затяжкой 74EF, была клонирована путем хождения по хромосомам, и единицы транскрипции, индуцированные экдизоном, были идентифицированы путем дифференциальной гибридизации с РНК слюнных желез, индуцированных и не индуцированных экдизоном (Janknecht et al., 1989; Burtis et al., 1990 ). Ген E74 большой, занимает около 60 т.п.н. ДНК и кодирует две перекрывающиеся единицы транскрипции, экспрессируемые с трех промоторов.Продукт E74A транскрибируется с одного промотора, а продукт E74B — с двух явно эквивалентных промоторов. Белковые продукты этих транскриптов имеют общую С-концевую область, которая содержит домен, характерный для членов суперсемейства протоонкогенов ets . Эти белки считаются ДНК-связывающими регуляторными белками (Karim et al., 1990). N-концевые области E74A и E74B кодируются разными экзонами, но оба богаты кислыми аминокислотами, что позволяет проводить сравнения с кислыми «активаторными» доменами других регуляторов транскрипции.В обоих белках домены разделены гомополимерными повторами. Эта структура убедительно свидетельствует о том, что продукты 74EF puff участвуют в регуляции транскрипции. ДНК-связывающие свойства E74A были изучены с использованием очищенного белка, экспрессированного в бактериях (Urness and Thummel, 1990). Три соседних сайта связывания были идентифицированы в середине гена E74 , на 11 т.п.н. ниже промотора E74A . Сайты содержат консенсусные последовательности, аналогичные последовательностям сайтов связывания других и членов семейства; это указывает на то, что белки E74 могут саморегулировать свою экспрессию. В соответствии с моделью антитела против E74A связываются с рядом сайтов политенных хромосом слюнных желез, включая как ранние (22B, 63F, 74EF и 75B), так и поздние (по крайней мере 18 основных сайтов, включая 62E, 63E, 78C и 82F). ) затяжки. Исследования с белком E74B показывают, что он связывается с теми же последовательностями, что и E74A (Karim, 1992).

Инициирование транскрипции с промотора E74A можно обнаружить через 5 мин после добавления экдизона в инкубированные личиночные органы; пик и последующее снижение уровней транскрипта через 6 часов в присутствии экдизона параллельно появлению и регрессу затяжки 74EF в аналогичных условиях.Накопление высоких уровней транскриптов E74A в постоянном присутствии экдизона и циклогексимида также имитирует поведение затяжки. Профиль развития экспрессии E74A показывает, что ген активен во время большинства импульсов экдизона, которые происходят при нормальном развитии. Экспрессия развития промоторов E74B аналогична экспрессии E74A на эмбриональной и ранней личиночной стадиях, но индуцируется раньше у личинок позднего третьего возраста и позже у куколок, чем у E74A. По крайней мере, некоторые из этих временных различий можно объяснить временем, необходимым для транскрипции первичного транскрипта E74A размером 60 т.п.н. (~ 1 час), в отличие от 15–30 минут для E74B (Karim and Thummel, 1991). Время, необходимое для продуцирования зрелой мРНК из длинных первичных единиц транскрипции, было задействовано как возможный регуляторный механизм (Thummel et al., 1990). Более подробный анализ экспрессии гена E74 в органах in vitro (Karim and Thummel, 1991) показывает, что E74B индуцируется концентрацией экдизона в 10 раз ниже, чем E74A (∼2 × 10 ^{— 9} M по сравнению с ∼2 × 10 ^-8 M ), что объясняет более раннюю экспрессию E74B у поздних личинок. При инкубации при концентрациях экдизона, которые вызывают максимальную активность, E74B активен только в течение 2 часов, а затем репрессируется (репрессия зависит от синтеза белка). Однако при субоптимальных концентрациях экдизона ниже 5 × 10 ^-8 M E74B не подавляется. Это предполагает, что для репрессии E74B требуется продукт, индуцированный концентрациями экдизона выше 5 × 10 ^-8 M; очевидным кандидатом будет ген E74A .Однако точка разрыва транслокации, которая разделяет промоторы E74 и удаляет функцию E74A , не влияет на экспрессию E74B (Burtis, 1985; Karim and Thummel, 1991).

Протяженность промоторных последовательностей E74A была определена с помощью анализов транскрипции in vitro и in vivo ; всего 80 п.н. последовательности выше, по-видимому, достаточно для эффективной экспрессии in vitro . Однако в анализах временной экспрессии для эффективной экспрессии требуются дополнительные 100 п.н. 5 ’последовательности.Для экспрессии требуются последовательности 43 п.н. ниже сайта начала транскрипции; консенсусный элемент ТАТА расположен в этой транскрибируемой области и необходим для транскрипции. В вышестоящих последовательностях, необходимых для экспрессии in vivo , сайты связывания для факторов транскрипции zeste и GAGA были идентифицированы с помощью анализов отпечатка in vitro (Thummel, 1989). Было показано, что антитела против фактора GAGA локализуются в затяжке 74EF в слюнных железах, поддерживая ассоциацию этого фактора транскрипции с промотором E74A (Tsukiyama et al., 1994). Наконец, свидетельство того, что эти элементы последовательности являются функционально важными, получены из анализа гена E74 в D. pseudoobscura и D. simulans. У обоих этих видов ген E74 хорошо консервативен на аминокислотном уровне, и с точки зрения вышестоящих последовательностей, нуклеотидная консервация является наиболее сильной по сравнению с сайтами связывания GAGA (Jones et al., 1991). Цис-действующие последовательности, необходимые для индукции экдизоном экспрессии E74 , еще предстоит локализовать, но предварительные данные свидетельствуют о том, что они могут располагаться в первом интроне E74A (Thummel et al., 1990).

E74A РНК и белок были локализованы в различных тканях, которые реагируют на экдизон как у поздних личинок, так и у предкуколок (Thummel et al., 1990; Boyd et al., 1991). Цитоплазматические РНК были обнаружены в тканях личинок, предназначенных для гистолиза (слюнные железы, жировое тело и кишечник), и имагинальных тканях, которые развиваются во взрослые структуры (глаза-антенны, диски крыльев и ног, а также центры пролиферации мозга). Распределение белка, которое является ядерным во всех исследованных тканях, в целом аналогично распределению РНК, за исключением случаев центров пролиферации головного мозга, где до сих пор не было обнаружено ни одного белка.Интересно, что пик экспрессии белка, по-видимому, отстает от пика экспрессии РНК по крайней мере на 2 часа, что повышает вероятность того, что экспрессия E74A регулируется посттранскрипционно. В этом отношении интересно отметить, что необычно длинный 5′-нетранслируемый лидер мРНК E74A содержит 17 коротких открытых рамок считывания до кодона инициации для E74A; они могут опосредовать регуляцию трансляции (Burtis et al., 1990).

Секвенирование генома путем ходьбы с последовательностями на конце клона: математический анализ

Серафим Бацоглу1,
Бонни Бергер1,2,
Джилл Месиров4, и
Эрик С.Посадочный модуль3,4,5

¹ Лаборатория компьютерных наук и кафедры
² Математика и
³ Биология, Массачусетский технологический институт, Кембридж, Массачусетс 02139 США;
⁴ Институт биомедицинских исследований Уайтхеда, Девять Кембриджский центр, Кембридж, Массачусетс 02142 США

Абстрактные

Одним из подходов к секвенированию большого генома является (1) секвенирование коллекции неперекрывающихся «семян», выбранных из геномного
библиотека клонов с большими вставками [таких как бактериальные искусственные хромосомы (BACs)], а затем (2) для последовательной «прогулки»
шаги путем выбора и секвенирования минимально перекрывающихся клонов с использованием такой информации, как последовательности на концах клона, для идентификации
перекрытия.В этой статье мы анализируем стратегические вопросы, связанные с использованием этого подхода. Выводим формулы, показывающие, как
два ключевых фактора, начальная плотность клонов семян и глубина геномной библиотеки, используемой для ходьбы, влияют на стоимость
и время проекта секвенирования, то есть количество избыточных секвенирований и количество шагов, которые необходимо покрыть подавляющее большинство
генома. Мы также обсуждаем вариантную стратегию, в которой вторая геномная библиотека с клонами, имеющими несколько меньший размер.
размер вставки используется для закрытия зазоров.Такой подход может значительно уменьшить количество избыточного секвенирования, не влияя на
скорость, с которой покрывается геном.

Полная последовательность ДНК генома — мощный инструмент для изучения организма. Биологические исследования в 21 веке
безусловно, потребует получения последовательности большого количества важных организмов, в том числе многих высших животных и растений.
с большими геномами.

Были предложены различные подходы для секвенирования больших геномов, которые в целом делятся на две категории: (1) полногеномные.
секвенирование дробовика и (2) секвенирование дробовика на основе клонов.

Секвенирование дробовика включает разбиение цели на случайные фрагменты, секвенирование этих фрагментов и восстановление полного
последовательность из этих кусков. Секвенирование дробовиком было изобретено Сэнгером, который применил его к геному бактериофага λ (Sanger et al.1980, 1982). Впоследствии он был расширен на геномы больших рекомбинантных плазмид, крупных вирусов, митохондрий, хлоропластов и бактерий.
(Охьяма и др., 1986; Гебель и др., 1990; Ода и др., 1992; Флейшманн и др., 1995). Совсем недавно Вебер и Майерс (1997) предложили распространить этот подход на очень большие геномы, такие как геном человека, за счет более широкого использования методов дальнего действия.
информация связывания, например, последовательностей на противоположных концах клонов с большими вставками.Есть много потенциальных ловушек,
например, возможность того, что огромное количество повторов (например, один миллион копий Alu-повтора в геноме человека) может
приводят ко многим крупномасштабным неправильным сборкам последовательностей, которые трудно обнаружить и исправить (Green 1997).

Секвенирование на основе дробовика на основе клонов включает получение коллекции клонов с крупными вставками, покрывающих геном и выполняющих дробовик
секвенирование каждого клона.Этот подход был использован для секвенирования геномов дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Оливер и др., 1992; Dujon, 1996) и Caenorhabditis elegans (Консорциум по секвенированию C. elegans , 1998) и используется для секвенирования геномов млекопитающих. такие как человек и мышь. Преимущество секвенирования на основе клонов
что это исключает возможность крупномасштабной неправильной сборки, потому что каждый клон собирается индивидуально, но для этого требуется
тот генерирует коллекцию клонов, покрывающих геном.У него также есть недостаток в том, что существует некоторая избыточная последовательность.
в результате перекрытия соседних клонов. (Нет работоспособной техники для секвенирования дробовика, только неперекрывающиеся
часть клона. Каждый клон должен быть подвергнут полному секвенированию дробовиком, поэтому перекрывающаяся часть должна быть
двукратная секвенция с дробовиком. Такого дублирования можно избежать на этапе направленной отделки, когда пробелы и неясности
последовательность дробовика разрешена.Таким образом, такие перекрытия увеличивают стоимость перекрывающейся области несколько менее чем в два раза.)

В настоящее время предпочтительной системой клонирования для секвенирования на основе клонов является бактериальная искусственная хромосома (BAC) со вставками
∼200 кб. Обсуждение ниже будет относиться к BAC (а не к общим «клонам с большими вставками»), но результаты, конечно же,
полностью общие.

Для создания клонов ВАС, подлежащих секвенированию, было предложено два подхода: (1) физическое картирование (или «сначала картирование, последовательность
второй ») и (2) ходьба (или« карта на ходу »).

Физическое картирование включает построение полной физической карты, покрывающей геном перед началом секвенирования (сначала карта,
последовательность вторая). Один «отпечаток пальца» библиотеки BAC, используя такую технику, как рестрикционное переваривание, чтобы охарактеризовать каждый клон,
а затем пытается использовать эту информацию для определения порядка клонов. Затем для секвенирования выбирается «путь» клонов.
Этот подход был успешно использован для создания физических карт космид, использованных для секвенирования S.cerevisiae и C. elegans геномов (Coulson et al. 1986; Olson et al. 1986). Он применяется к человеческому геному, хотя проблема более сложна из-за больших размеров клонов (давая
более сложные отпечатки пальцев), больший размер генома и более сложная структура повторов.

Ходячий подход переходит непосредственно к секвенированию без предварительной физической карты: первый начинается с секвенирования исходной коллекции
случайных клонов, а затем «обходит» геном, итеративно выбирая минимально перекрывающиеся клоны.Venter et al. (1996) предложили эффективный метод отбора клонов с минимальным перекрытием, который обычно называют «секвенирование на конце ВАС».
или, более формально, как «соединители с тегами последовательностей» (STC). Библиотека ВАС характеризуется секвенированием вставок каждого
клонировать на его двух концах (используя праймеры, расположенные в двух плечах вектора), и база данных результирующих последовательностей на концах ВАС
созданный. Учитывая полностью секвенированный клон C BAC, можно пройти, выполнив поиск в базе данных, чтобы идентифицировать все перекрывающиеся BAC.В
расположение и ориентация каждого перекрывающегося ВАС сразу видно из положения его конечной последовательности в пределах C (Рис.1). Можно также определить, закрывает ли перекрывающийся ВАС разрыв в геномной последовательности, по тому, находится ли другая его конечная последовательность
в другом полностью секвенированном клоне C ‘ВАС.

Фигура 1.

Перекрывающиеся BAC в библиотеке с глубиной d = 12-кратное.Типичный BAC (показан черным) будет иметь 12 BAC, перекрывающих его правый конец, и 12 BAC, перекрывающих его правый конец.
левый конец. Каждый перекрывающийся клон может быть идентифицирован, поскольку одна из его конечных последовательностей (показана стрелками) содержится внутри
последовательность целевой ВАС. Точное положение каждого перекрывающегося клона определяется расположением и ориентацией.
конечной последовательности в последовательности целевой ВАС.

Целью данной статьи является анализ стратегии секвенирования генома с помощью ходьбы на основе клонов.Хотя основное понятие
ходьбы проста, ключевые стратегические вопросы не решены: сколько самостоятельных прогулок следует выполнить
в параллели? Если их слишком мало, потребуется слишком много шагов, чтобы покрыть геном за разумное время. Слишком много, один
может выполнять слишком много повторяющихся последовательностей, поскольку прогулки «натыкаются» друг на друга со случайным — и, следовательно, неоптимальным — перекрытием. Как
можно ли максимизировать скорость покрытия генома при минимизации количества избыточного секвенирования?

Цель данной статьи — представить математический анализ, который выражает количество избыточной последовательности в терминах
начальной плотности прогулок и глубины библиотеки BAC.Мы также описываем и анализируем вариант стратегии, в котором
один использует вторую библиотеку ВАС с меньшими клонами-вставками для эффективного закрытия пробелов; эта стратегия резко снижает
количество избыточной последовательности. Результаты служат прямым руководством для планирования проекта секвенирования генома.

Базовая модель

Начнем с описания базовой модели, которую необходимо проанализировать.

Библиотека BAC

Сначала мы рассмотрим случай единственной библиотеки BAC со следующими свойствами: (1) Клоны имеют постоянный размер.
л . Размер клона L будет служить нашей единицей расстояния, поэтому мы можем установить L = 1. (Позже мы рассмотрим использование второй библиотеки BAC со вставками постоянного размера L ′ <1.) (2) Клоны представляют собой случайные сегменты генома. Таким образом, мы игнорируем возможность смещения клонирования. (3) Библиотека покрывает геном на глубину d ; то есть среднее количество клонов, покрывающих точку в геноме, составляет d . (4) Все клоны в библиотеке были секвенированы с обоих концов, что дало достаточную уникальную последовательность для надежного обнаружения
перекрывать. Таким образом, мы игнорируем возможность того, что некоторые концы BAC могут быть не упорядочены из-за технических ошибок или могут
содержат повторяющиеся последовательности, из-за которых невозможно распознать перекрытие.

Секвенирование

Мы предполагаем, что процедура геномного секвенирования удовлетворяет следующим условиям: (1) Стоимость секвенирования BAC составляет
прямо пропорциональна длине его вставки. Это согласуется с современной практикой в крупных центрах геномного секвенирования,
которые выполняют фиксированное количество последовательностей дробовика на килобазу размера вставки.[Постоянное количество чтений на килобайт не может
быть точно оптимальным. С одной стороны, было высказано предположение, что для более мелких клонов может потребоваться немного меньше операций чтения на килобайт для достижения
закрытие (Roach 1995). С другой стороны, для меньших клонов может потребоваться немного больше считываний на килобайт вставки, поскольку вектор клонирования содержит
немного большая доля от общей длины клона и, следовательно, считываний из библиотеки дробовика. В любом случае эти
эффекты небольшие и компенсирующие.] (2) Стоимость изготовления библиотеки дробовика с малым вкладышем из BAC (что включает в себя подготовку,
разрезание и клонирование ДНК) ничтожно мала по сравнению со стоимостью выполнения считываний дробовиком, необходимых для секвенирования ВАС.
Это отражает текущую практику, для которой первое составляет лишь ~ 2% от второго.

В принципе, можно секвенировать геном с минимальным перекрытием путем секвенирования одного исходного клона C ₀, а затем последовательного движения наружу, секвенируя минимально перекрывающиеся клоны, C _-i и C _i, с каждой стороны до одного покрывает весь геном (рис.2). Результирующая последовательность клонов обычно называется минимальным тайлинг-путем. (Строго говоря, следует сослаться на
как минимальный путь мозаики для данной библиотеки и выбор начального клона.) На каждом этапе минимально перекрывающийся клон C _i идентифицируется путем сравнения базы данных последовательностей BAC-конца с завершенной последовательностью C _i-1 с найдите последовательность BAC-конца, которая находится ближе всего к растущему концу и направлена наружу (рис. 1). Мы предполагаем, что всегда есть хотя бы один перекрывающийся клон, указывающий наружу.Это разумное предположение при условии, что
что глубина d достаточно велика. Например, библиотека ВАС со вставками размером 200 т.п.н., покрывающими геном млекопитающего размером 3 × 10 ⁹ п.н. до глубины d = 10, должна давать только 6,8 пробелов без учета концов хромосом (Lander and Waterman 1988).

Фигура 2.

Последовательное прохождение генома от единственного исходного клона C ₀.

Анализировать ожидаемое количество избыточной последовательности несложно. В среднем каждый последующий клон перекрывает
предыдущая последовательность на (1/ d ) ее длины и обеспечивает [1 — (1/ d )] новой последовательности. Соотношение избыточной последовательности к уникальной последовательности, таким образом, составляет: R = d
⁻¹ / (1 — д
⁻¹) = 1 / ( d — 1).Библиотека BAC с глубиной d = 10, таким образом, дает минимальный путь мозаики с избыточной последовательностью 11,1%, тогда как библиотека с глубиной d = 20 влечет за собой избыточную последовательность 5,3%.

На самом деле, секвенирование больших геномов последовательной ходьбой совершенно непрактично из-за продолжительности цикла обработки каждого BAC.
clone: геном млекопитающего потребует 15 000 последовательных шагов. Секвенирование каждого ВАС требует выращивания клона, подготовки ДНК,
разрезание ДНК, конструирование библиотеки дробовика с малой вставкой, выполнение секвенирования клонов из дробовика с малой вставкой
библиотека, компилирующая чтения на компьютере и закрывающая оставшиеся пробелы.Различные этапы оценки качества выполняются вместе
способ обеспечить высокую урожайность. Хотя каждый отдельный шаг прост, общее прошедшее время в настоящее время
порядка 1–2 месяцев.

Очевидное решение — обрабатывать множество BAC параллельно, то есть одновременно идти от многих клонов семян (рис. 3). В идеале семенные клоны должны быть достаточно плотными, чтобы можно было покрыть подавляющую часть генома за небольшое количество
пешеходные шаги.Разумной целью было бы охватить геном млекопитающего за ~ 1 год.

Рисунок 3.

Последовательное прохождение генома из коллекции клонов семян (показано черным). Показаны шаги для ходьбы в двух направлениях, с
шаги, закрывающие океан, показаны серым цветом. Океаны закрыты с относительно небольшим перекрытием в первых двух случаях, но с
большое перекрытие в третьем случае [отмечено звездочкой (*)].

Однако параллельная ходьба создает проблему: различные прогулки могут соединяться с большим перекрытием, что значительно увеличивает
доля избыточной последовательности. На рисунке 3, например, показаны три клона (показаны серым цветом), которые присоединяются к прогулкам. Первые два случая включают прогулки, которые случайно
встречаются с относительно небольшим перекрытием, но третий случай (отмеченный звездочкой) включает прогулку, которая встречается с большими
перекрываются и, таким образом, приводят к значительной избыточной последовательности.

Важно понимать, как ожидаемая доля избыточного секвенирования зависит от плотности посевных клонов и
глубина библиотеки. В следующем разделе представлен математический анализ. Читателя интересуют в первую очередь приложения
возможно, пожелает перейти непосредственно к результатам.

Математический анализ

Наша цель — вывести простые формулы, обеспечивающие хорошее приближение для доли избыточного секвенирования.К этому
В конце сделаем некоторые упрощающие предположения. Тогда разумность приближений будет продемонстрирована их
полное согласие с моделированием, приведенным ниже.

Начнем с коллекции неперекрывающихся клонов семян. Следуя терминологии Лендера и Уотермана (1988), каждый клон — это «остров», за которым следует «океан», по которому нужно идти. Ходьба идет наружу от каждого клона в двунаправленном
моды, с перекрывающимися клонами, распознаваемыми на основе их конечной последовательности.В каждом раунде выявляются экземпляры в
какие два островка могут быть соединены одним клоном (что легко понять из двух концевых последовательностей) и гарантирует, что ходящий
шаг берется только с одного из двух островов (чтобы избежать ненужного лишнего секвенирования).

Хотя на практике ходьба идет в двух направлениях, это упрощает обсуждение, предполагая, что ходьба идет в одном направлении.
Направо.Каждый двунаправленный шаг ходьбы явно эквивалентен двум однонаправленным шагам ходьбы. На рис. 4 показан типичный клон семян C ₀, за которым следуют последовательные шаги ходьбы C ₁, C ₂,…, C _j, где C _j — первый клон, который перекрывает клон семян справа. из C ₀ (факт, который легко очевиден из его конечной последовательности).

Рисунок 4.

Однонаправленное движение от семенного клона C ₀. Каждый последующий клон C _i расширяет остров с избыточной последовательностью, показанной серым цветом. Последний клон C _j закрывает океан с избыточным секвенированием из-за перекрытия как с C _j-1, так и со следующим семенным клоном справа. Каждый клон имеет размер 1, а размер океана — X . Число секвенированных клонов составляет j + 1, каждый из которых имеет длину 1.Размер полученной уникальной последовательности (исходный остров вместе с океаном) составляет X + 1.

Предположим, что семена покрывают пропорцию π генома в клонах длиной 1. Следовательно, океаны покрывают пропорцию 1 — π,
и средний размер океана должен быть θ = (1 — π) / π.

Наше первое упрощающее предположение касается длины океана: Предположение об экспоненциальном океане (AEO). Предполагается, что неперекрывающиеся семенные клоны выбраны таким образом, чтобы полученные длины океана следовали экспоненциальному распределению.
(со средним θ).

Какова доля избыточного секвенирования, связанного с секвенированием острова C ₀ вместе с океаном справа от него? Пусть случайная величина J обозначает сумму длин C ₁, C ₂,…, C _j.(Поскольку клоны имеют единичную длину, J = j .) Сумма полного секвенирования составляет J + 1, тогда как количество полученных уникальных последовательностей составляет X + 1 (см. Рис. 4). Ожидаемая доля избыточной последовательности, таким образом, где E () обозначает ожидаемое значение. Как отмечалось выше, средний размер океана E ( X ) равен θ = (1 — π) / π. Следовательно, нам просто нужно вычислить E ( J ).

Точное вычисление E ( J ) сложно, но можно сделать хорошую оценку, используя второе упрощающее предположение:

Предположение о постоянном перекрытии (ACO). Предполагается, что каждый клон C _i перекрывает предыдущий клон C _i-1 точно на ожидаемую величину перекрытия, 1/ d , и, таким образом, расширяет последовательность точно на ожидаемую величину, 1 — ( 1/ д ).

ACO значительно упрощает математический анализ благодаря элегантному свойству экспоненциального распределения: если каждый остров
увеличивается на постоянную величину, тогда длины остальных океанов (т.е., те, которые не закрыты) следуют тем же
экспоненциальное распределение как начальные океаны. Это свойство устойчивости позволяет анализировать процесс ходьбы простым
рекурсия.

Предложение 1

Предположим, что геном секвенирован путем посева неперекрывающихся клонов до покрытия π и затем ходьбы с использованием библиотеки
глубиной d .Пусть θ = (1 — π) / π. Предполагая, что размеры океана распределены экспоненциально (AEO) и последовательные шаги ходьбы имеют
постоянное перекрытие (ACO), мы имеем следующее: (i) Ожидаемая доля избыточной последовательности составляет (ii) E ( J ) = 1/ p
_{d , θ}, где p
_{d , θ} — 1 = e
^{— (1− d ⁻¹} ^{) / θ} — вероятность того, что океан закрывается за один шаг ходьбы.(iii) Доля генома, не секвенированная после
k шагов для ходьбы в одном направлении (1 — π) (1 — p
_{d , θ}) ^k = (1 — π) e
^{— k (1 — d ⁻¹} ^{) / θ}. Таким образом, пропорция геометрически уменьшается с каждым шагом ходьбы.

Проба

Часть I была отмечена выше.Формальное доказательство следует из прямого применения уравнения Вальда (см. Ross 1970). В части II используется ACO. Общая длина клона Дж , необходимая для закрытия океана, может быть рассчитана с учетом одного шага ходьбы. С вероятностью р
_{d , θ}, ступенька закрывает океан, в результате общая длина клона равна 1. С вероятностью 1 — p
_{d , θ}, ступеньке не удается закрыть океан и оставляет оставшийся океан с таким же экспоненциальным распределением.Из рекурсии следует
что E ( J ) = ( p
_{d , θ}) 1 + (1 — p
_{d , θ}) [1 + E ( J )]. Желаемый результат следует из решения для E ( J ). Часть iii следует из наблюдения, что длины оставшихся океанов после продолжения тыс. шагов ходьбы следуют тому же экспоненциальному распределению.Таким образом, общая длина океана, остающаяся после k шагов, прямо пропорциональна доле океанов, которые остаются незамкнутыми после k шагов. Доля остальных океанов, которые закрываются на каждом шаге ходьбы, составляет p .
_{d , θ}, и, таким образом, пропорция, остающаяся незамкнутой после k шагов, равна (1 — p
_{d , θ}) ^к. Это завершает доказательство.

Предложение 1 (i) может быть обобщено на любое распределение начальных размеров океанов следующим образом:

Предложение 2

Предположим, что геном засеян, как в предложении 1, но размеры океана x имеют плотность вероятности f ( x ). Предполагая, что ACO, ожидаемая доля избыточной последовательности находится где-то, а ⌈ x ⌉ обозначает функцию верхнего предела (т.е., наименьшее целое число ≥ x ).

Проба

При ACO каждый шаг увеличивается на расстояние (1 — d
^-1). Число J шагов, необходимых для закрытия океана размером x , составляет, таким образом, ⌈ x / (1 — d
⁻¹) ⌉. Результат следует просто из ожидания Дж по распределению размеров океана.

Результаты

Теперь применим полученные результаты для изучения проблемы секвенирования генома при ходьбе. На рис. 5A показано соотношение R избыточного секвенирования как функция начальной средней длины океана θ и глубины библиотеки ВАС d . Если геном засевается так, чтобы покидать океаны средней длины θ = 1 (соответствует начальному охвату π = 50%), пропорция
избыточного секвенирования составляет от 32% до 29%, поскольку глубина библиотеки ВАС колеблется от d = 15 до d = ∞.Если геном засевается более редко, так что θ = 2 и π = 33%, избыточное секвенирование R колеблется от 23% до 18% в том же диапазоне глубины библиотеки ВАС. Если океаны еще больше (θ = 3 и π = 25%), то
избыточная последовательность R составляет от 19% до 13%.

Рисунок 5.

Доля избыточного секвенирования.( A ) Кривые показывают долю избыточного секвенирования R ( d , θ) как функцию среднего начального размера океана θ для различных глубин библиотеки d = 10, 15, 25, 50 и ∞ . ( B ) Кривые показывают долю избыточного секвенирования, связанного с неэффективным закрытием океана, R * ( d , θ). Это получается путем вычитания доли избыточной последовательности для оптимального пути тайлинга в библиотеке глубины.
d , что составляет 1 / ( d — 1).То есть R * ( d , θ) = R ( d , θ) — (1/ d — 1).

Полезно сравнить результаты с ситуацией последовательного обхода всего генома с минимальным тайлинг-путем (который
соответствует размеру океана θ → ∞). Как отмечалось выше, доля избыточной последовательности для минимального пути мозаичного изображения составляет 1 / ( d — 1).Вычитая это количество из R , мы находим дополнительную избыточную последовательность R *, вызванную неэффективным закрытием океанов. На рисунке 5B показан соответствующий график для R *.

График показывает, что избыточная последовательность, вызванная неэффективным закрытием океанов, зависит в первую очередь от среднего уровня океана.
размер но намного меньше по глубине библиотеки d . Это имеет интуитивный смысл, потому что неэффективность возникает в первую очередь из-за закрытия небольших океанов клонами единичной длины.Таким образом, наличие большего количества клонов в глубокой библиотеке дает лишь незначительное улучшение. Компонент R * уменьшается всего на несколько процентных пунктов при переходе от библиотеки с d = 10 к d = ∞.

На рис. 6 показано количество шагов при ходьбе в одном направлении, необходимых для покрытия 90% генома. Количество однонаправленных ступеней
равна чуть более чем удвоенной средней длине океана.Поскольку настоящая ходьба идет в двух направлениях, это полезно.
переформулируем наблюдение в следующих терминах: Число двунаправленных пешеходных шагов, покрывающих 90% генома, приблизительно равно средней длине океана. (Точное соответствие зависит от глубины библиотеки d . Например, количество двунаправленных шагов ходьбы в ~ 1,1 раза больше средней длины океана, когда d = 15.)

Рисунок 6.

Шагающие ступеньки. Количество шагов, совершаемых при ходьбе в одном направлении, требовало покрытия 90% генома в зависимости от среднего начального значения.
размер океана θ для различных глубин библиотеки d = 10, 15, 25, 50 и ∞. На практике ходьба происходит в обоих направлениях. Количество двунаправленных шагов ходьбы
таким образом вдвое меньше.

Если количество шагов, показанных на рисунке 6, удвоится, доля секвенированного генома возрастет до 98–99%.[Точнее, оставшаяся непокрытая доля составляет 1% × (1 — π) ^-1.] Таким образом, количество двунаправленных шагов ходьбы, покрывающих 98% генома, примерно равно удвоенному среднему значению океана
длина.

Из рисунков 5 и 6 можно легко оценить увеличение избыточного секвенирования, связанное с охватом подавляющего большинства генома в данном конкретном случае.
количество ступеней.

Использование меньших клонов для закрытия пробелов

Основная неэффективность ходьбы возникает из-за случаев, когда клон длиной L = 1 должен быть секвенирован, чтобы закрыть небольшой океан; большая часть последовательности является избыточной. Это наблюдение предлагает простое улучшение:
Используйте вторую библиотеку BAC с меньшими вставками, чтобы закрыть небольшие океаны.

В частности, предположим, что у нас есть две библиотеки ВАС, в которых клоны секвенированы по концам: наша исходная библиотека B с
вставка размером L = 1 и глубиной d , а также вторая библиотека B ′ с размером вставки L ′ <1 и глубиной d ′. Мы продолжим предполагать, что переход от каждого семенного клона идет однонаправленно вправо (но см. Ниже, что касается
эта точка).На каждом шаге ходьбы мы сначала будем искать в нашей базе данных, есть ли клон из B ‘, который охватывает оставшиеся
океан (на основе его конечных последовательностей), и если ничего не найдено, мы бы выбрали минимально перекрывающийся клон из B (который либо
закрывает океан или продлевает прогулку). Таким образом, мы стремимся выбрать наименьшего клона, способного закрыть океан.

Мы можем адаптировать приведенный выше математический анализ для расчета доли избыточной последовательности.[Чтобы упростить утверждение
В результате мы будем рассматривать только случай, когда клоны из B обычно расширяют путь дальше, чем клоны из B ‘;
то есть 1 — (1/ d )> L ′ — (1/ d ′). Это будет верно, если L ′ не близко к 1, и в этом случае вторая библиотека все равно мало что добавляет.]

Предложение 3

Пусть B и B ‘обозначают библиотеки BAC, как указано выше.Предположим, что мы изначально засеваем геном неперекрывающимися клонами от B до
покрытие π, а затем ходите, как указано выше, используя клонов из B ‘, чтобы закрыть океаны, когда это возможно. Пусть θ = (1 — π) / π. Под УЭО
и ACO, мы имеем следующее: (i) Пусть случайная величина J обозначает сумму длин клонов, используемых для закрытия океана. Как и прежде, ожидаемая доля избыточного секвенирования
is (ii) с p
_{d , θ}, определенный как в предложении 1, мы имеем Формула сводится к формуле предложения 1, если меньшая библиотека вставок B ‘не имеет клонов ( d ′ = 0), потому что p
_{0, θ / L ′} = 0.

Проба

Мы действуем так же, как при доказательстве предложения 1. Часть i снова следует простым применением уравнения Вальда. Что касается части ii,
мы вычисляем E ( J ), учитывая один шаг ходьбы и применяя рекурсию.С вероятностью р
_{d ′, (θ / L ′)}, океан может быть закрыт клоном из библиотеки B ′, в результате общая длина клона составляет L ′. С вероятностью р
_{d , θ} — p
_{d ′, (θ / L ′)}, океан может быть закрыт клоном из библиотеки B, но не B ′, в результате общая длина клона равна 1. С вероятностью
1 — п.
_{d , θ}, шаг ходьбы не может закрыть океан и остающийся океан, имеющий такое же экспоненциальное распределение.Таким образом, следует
рекурсия, что E ( J ) = [ p
_{d ′, (θ / L ′)}]. л ′ + [ л
_{d , θ} — p
_{d ′, (θ / L ′)}] 1 + (1 — p
_{d , θ}) [1 + E ( J )]. Результат следует путем решения для E ( J ).

Насколько эффективна вторая библиотека B ‘с меньшими клонами-вставками? На рисунке 7 показана доля избыточного секвенирования, когда исходная библиотека B с глубиной d = 15 дополняется второй библиотекой B ‘с клонами, чьи вставки вдвое короче ( L ′ = ½) на различной глубине d ′.

Рисунок 7.

Доля избыточного секвенирования для ходьбы с двумя библиотеками ВАС. Первая библиотека B имеет клоны с размером вставки L = 1 и фиксированной глубиной d = 15, тогда как вторая библиотека B ‘имеет клоны с размером вставки L ′ = ½ и различной глубиной d ′. Ходьба выполняется так, как описано в тексте. Кривые показывают долю избыточного секвенирования как функцию среднего
начальный размер океана θ и для различных глубин библиотеки ( d = 10, 15, 25, 50 и ∞) для второй библиотеки B ‘.

Значительная экономия, например, уменьшение доли избыточного секвенирования с ∼23% –14% для средней длины океана.
2 и от ∼18% –12% для средней длины океана 3. Избыточная последовательность значительно ближе к полученному наилучшему возможному уровню.
с минимальным тайлинг-путем ∼7,1% для библиотеки с d = 15 (обозначено пунктирной линией на рис.7). Использование библиотеки с клонами половинного размера примерно вдвое сокращает избыточное секвенирование R ‘, вызванное неэффективным закрытием океанов.

Примечательно, что вторая библиотека B ‘не должна иметь большую глубину, чтобы иметь большое влияние. Библиотека с глубиной d = 5 лишь немного менее эффективна, чем библиотека с бесконечной глубиной. Это имеет интуитивный смысл, потому что даже относительно
малая глубина гарантирует существование клонов, подходящих для покрытия очень маленьких океанов.

Приведенные выше результаты относятся ко второй библиотеке B ‘с размером вставки L ‘ = ½. Этот выбор размера вставки L ′ почти оптимален для минимизации количества повторяющихся секвенирований R . В частности, прямым расчетом можно показать, что значение L ′, которое минимизирует R , изменяется только от 0,55 до 0,50, когда средняя длина океана θ изменяется от 1 до ∞.

Приведенный выше анализ предполагает, что переход от каждого семенного клона идет однонаправленно вправо.Тот факт, что ходьба
на самом деле двунаправлен, немного усложняет ситуацию: если бы все клоны для данного раунда ходьбы были секвенированы
одновременно, мы иногда неэффективно покрывали океаны, идя с большими клонами на обоих концах, когда использовали один большой
и одного небольшого клона будет достаточно (рис.8). Можно показать, что дополнительное избыточное секвенирование, которое может возникнуть в результате таких случаев,
[Вкратце, первый член — это избыточный вклад в J от секвенирования большого клона вместо короткого; второй член — это доля океанов, которая должна правильно
быть закрытым одним большим и одним маленьким клоном (это как раз те океаны, которые были бы закрыты однонаправленной ходьбой).
с нечетным числом больших клонов, за которыми следует маленький клон), а знаменатель (θ + 1) встречается как при вычислении
R в 2 ( и ) выше.] Для типичных представляющих интерес значений (например, d ≥ 15, d ′ ≥ 5, L = ½ и θ = 1–5) дополнительное избыточное секвенирование будет в диапазоне 3%.

Рисунок 8.

Схематическое изображение ситуации, когда океан закрывается двумя большими клонами (B и B ‘), когда один большой и один маленький
clone (B и B ′ ′) будет достаточно.

Можно добиться большего, если использовать тот факт, что не все клоны ВАС будут секвенироваться одновременно.
Поскольку последовательность дробовика получается для каждого большого клона B, можно автоматически проверить последовательность, чтобы увидеть, будут ли какие-либо последующие
большой клон B ‘может быть заменен закрывающим океан маленьким клоном B’ ‘(как на рис.8). При условии, что B ‘не проходил через секвенирование дробовиком одновременно с B, тем самым можно избежать затрат на секвенирование.
больший клон, когда будет достаточно меньшего клона. (Кто-то мог понести затраты на подготовку библиотеки с небольшими вставками из
B ‘, но это мало по сравнению со стоимостью секвенирования.) Дополнительное избыточное секвенирование, следовательно, составляет только αρ, где α <1 представляет собой долю клонов на данном шаге ходьбы, которые обрабатываются параллельно посредством секвенирования дробовика.Пропорция α зависит от рабочего процесса операции секвенирования, в частности, от объема незавершенной работы (WIP) в дробовике. этап секвенирования. Поскольку этап секвенирования ружья относительно быстрый (время, затраченное на сбор, выращивание, подготовку, и секвенирование клонов с малой вставкой обычно занимает порядка недели), WIP имеет тенденцию быть относительно небольшим. Даже если доля клонов, одновременно проходящих секвенирование дробовиком, достигает α = 10%, дополнительное избыточное секвенирование из-за случайного отказа от использования небольшого клона только αρ = 0.3%. Короче говоря, стоимость небольшая и существенно не повлияют на преимущество использования библиотеки меньшего размера. Таким образом, результаты, полученные при предположении об однонаправленной ходьбе, являются не за горами.

Оптимизация глубины библиотеки BAC

Какова оптимальная глубина библиотеки ВАС, которая будет использоваться для секвенирования генома при ходьбе? Можно снизить стоимость резервных
секвенирование с использованием более глубоких библиотек ВАС, но влечет за собой расходы на конечное секвенирование большего числа клонов ВАС.Вне
в какой-то момент увеличивается отдача от увеличения глубины библиотеки BAC.

Оптимальная глубина библиотеки зависит от относительной стоимости секвенирования целых клонов ВАС по сравнению с секвенированием концов ВАС. С нынешним
По лабораторным методикам и экономике это соотношение находится в районе ρ = 1000: 1. (Примерно 4000 реакций секвенирования с дробовиком
необходимы для секвенирования ВАС размером 200 т.п.н.Для упорядочивания концов требуются две реакции секвенирования, хотя эти реакции
значительно дороже, поскольку для секвенирования непосредственно с матрицы ВАС требуются более высокие концентрации реагентов.)
Учитывая соотношение затрат ρ, оптимальной глубиной библиотеки является значение d , которое минимизирует сумму затрат на секвенирование на конце ВАС (пропорционально d ) и избыточной последовательности ВАС [пропорционально R ( d , θ)].

На рисунке 9 показана оптимальная глубина библиотеки при использовании одной библиотеки ВАС (кривая обозначена d *). Оптимальная глубина увеличивается с начальной средней длиной океана θ или, что то же самое, уменьшается с начальной пропорцией
π покрываемого генома. Оптимальная глубина d находится в диапазоне от 22,5 до 30,8 при увеличении θ от 1 до 8, приближаясь к асимптотическому пределу 32,8 при θ → ∞. (Можно показать, что
оптимальная плотность библиотеки приближается к √ρ + 1 при θ → ∞, используя прямое исчисление для минимизации асимптотической суммы
Стоимость.) Тот факт, что оптимальное значение d меньше для малых θ, имеет интуитивный смысл, потому что плотная библиотека предлагает более ограниченное преимущество, когда большинство океанов
довольно маленький.

Рисунок 9.

Оптимальная глубина библиотеки для минимизации общей стоимости при условии, что соотношение затрат на получение полной последовательности
BAC к стоимости секвенирования обоих концов BAC составляет ρ = 1000: 1.Верхняя кривая (обозначенная d *) показывает оптимальную глубину при использовании одной библиотеки. Две нижние кривые показывают оптимальные глубины d и d ′ при использовании двух библиотек B и B ′, как описано в тексте. Оптимальные глубины зависят от среднего начального размера океана θ. В
глубина d ′ небольшой библиотеки вставок была ограничена как минимум 5, чтобы гарантировать наличие правильно расположенной маленькой вставки
clone в конце подавляющего большинства островов, что согласуется с предположением ACO, описанным в тексте.

На рисунке 9 также показаны оптимальные глубины библиотеки d и d ′ при использовании двух библиотек ВАС с соответствующими размерами вставок 1 и ½. Оптимальное значение d для большой библиотеки вставок лишь немного ниже, чем в предыдущем случае, тогда как оптимальное значение d ′ находится в районе 6–7 для соответствующих значений θ.

Оптимум относительно широк. В целом кажется разумным использовать библиотеки B и B ′ с соответствующими глубинами d = 20–25 и d ′ = 6–7.

Посев генома

Теперь мы переходим к вопросу создания коллекции неперекрывающихся клонов семян.Приведенный выше анализ предполагает, что клоны семян
выбираются таким образом, чтобы начальные размеры океана были распределены экспоненциально (AEO). Насколько близко к этому можно подойти на практике?

Самый простой экспериментальный подход заключается в последовательном отборе семян из списка случайных клонов. Каждый клон
выбранный и упорядоченный, при условии только того, что он не перекрывается (как видно из его конечных последовательностей) с ранее
выбранный клон семян.Таким образом можно постепенно засеять геном случайными неперекрывающимися клонами.

Этот случайный процесс известен в литературе как «процесс парковки», потому что он эквивалентен автомобилям постоянного размера.
(клоны) последовательно выбирают случайные парковочные места на длинной улице (геном). Каждому автомобилю разрешается припарковаться в выбранном
место для парковки при условии, что оно не заблокировано ранее припаркованной машиной; в противном случае он должен уехать.

Получающееся в результате «распределение парковок» имеет отношение ко многим физическим процессам и хорошо изучено (Крапивский, 1992). Предположим, что кто-то обработал список случайных клонов, составляющих подбиблиотеку, охватывающую геном до глубины –. Ожидаемая доля генома, покрытого клонами семян, будет π ( t ), а распределение размеров океанов будет θ ( x, t ), где

Парковочное распределение размеров океана очень близко к экспоненциальному распределению для низкого покрытия π ( t ) и все еще достаточно близко для покрытия π ( t ) = 50% (рис.10А, Б).

Рисунок 10.

Сравнение парковочного и экспоненциального распределений. ( A ) Плотность вероятности и ( B ) кумулятивное распределение вероятностей для π = 0,3 и π = 0,5. Изогнутые кривые — распределение парковки; гладкий
кривые — экспоненциальное распределение с тем же средним значением.

Ожидаемую долю избыточной последовательности при распределении парковок можно рассчитать, как в предложении 2. Разница
Δ между избыточной последовательностью, ожидаемой при экспоненциальном распределении, и распределениями парковки, показано на рисунке 11. Распределение парковки влечет за собой немного меньшую избыточную последовательность, чем экспоненциальное распределение (т.е.е., Δ> 0), поскольку
у него меньше предельно малых интервалов (как показано на рис. 10А). Разница Δ довольно мала в интересующем диапазоне, составляя ∼0,6% для θ = 1 и уменьшаясь с увеличением θ.

Рисунок 11.

Разница между экспоненциальным распределением и распределением парковки. График показывает разницу Δ между R
_exp, доля избыточной последовательности при экспоненциальном распределении, и R
_{парковка}, доля превышения последовательности при распределении парковок.То есть Δ = R
_эксп. — R
_{паркинг}. Показаны две кривые, соответствующие d = 15 и d = 50. Видно, что разница Δ в значительной степени нечувствительна к d .

Следует отметить, что процесс парковки не может полностью покрыть геном: по мере увеличения покрытия оставшиеся места
становится меньше, а доля отвернувшихся машин увеличивается.Когда все оставшиеся места меньше длины автомобиля,
больше нельзя парковать машины. Это происходит на так называемом «пределе помех», который происходит при π = 0,747597… последовательный выбор
строго неперекрывающиеся клоны, таким образом, не могут обеспечить покрытие семян за пределами этой точки.

К счастью, мы не заинтересованы в посеве до> 50%, потому что стоимость избыточного секвенирования начинает стремительно расти при π> 50%.Для посева генома на 50% необходимо начать со случайного списка клонов, покрывающего геном до глубины 1,15 [потому что π (1,15)
∼0,5].

Мы кратко упоминаем некоторые другие подходы к засеиванию генома, но не анализируем их подробно.

Одновременный посев

Можно начать с набора случайных клонов, подготовить библиотеку для дробовиков с небольшой вставкой из каждого и выполнить небольшое количество
секвенирования из каждой библиотеки дробовика (например,g., покрывая клон в среднем на 0,5-кратную глубину). Такое «секвенирование образцов»
должно быть достаточно для обнаружения любого значительного перекрытия между клонами. Тогда можно было бы выбрать максимальный набор неперекрывающихся
клоны. Если коллекция случайных клонов покрывает геном на глубину t , максимальный неперекрывающийся набор будет охватывать пропорцию π ∼ t / ( t + 1) генома, и океаны будут почти экспоненциально распределены с средний размер 1/ т .Такой подход позволяет засеять геном до более высокого начального покрытия, но секвенирование образца дороже, чем
конец последовательности, и все это должно быть выполнено заранее. Тем не менее, могут быть ситуации, в которых такой подход может быть желательным.

Посев на основе контигов

Первоначально можно было выполнить отпечаток всей библиотеки BAC для создания неперекрывающихся контигов, которые можно было бы использовать в качестве начальных значений.
для последующей ходьбы.Если предположить, что контиги были разделены примерно экспоненциально распределенными океанами, ситуация
может быть проанализирован таким же образом, как указано выше.

Симуляторы

Приведенные выше простые формулы основаны на двух упрощающих предположениях (AEO и ACO).Мы проверили, соответствуют ли предоставленные формулы
разумные приближения путем выполнения обширного моделирования.

Моделирование было выполнено следующим образом: библиотеки были созданы путем случайного выбора начальных точек для клонов ВАС ( L = 2 × 10 ⁵ п.н., L ′ = 1 × 10 ⁵ п.н.) из генома млекопитающего ( 3 × 10 ⁹ п.н.) с использованием равномерного распределения для достижения желаемых глубин d и d ′.Первоначальный отбор клонов семян был сгенерирован, как в задаче о парковке, путем рассмотрения клонов в случайном порядке.
и прием последовательных неперекрывающихся клонов до тех пор, пока не будет достигнута желаемая пропорция π генома. [Мы подтвердили, что
размеры океана, полученные в результате моделирования, точно соответствуют распределению парковок (не показано).] Затем был выполнен переход путем выбора
минимально перекрывающиеся BAC, как описано выше. Для каждого выбора параметров было выполнено 40 симуляций, и
результаты усреднены.Моделирование проводилось для параметров во всем интересующем диапазоне, при параметрах d ∈ {10, 15, 25, 50, ∞} и θ = {1.0, 1.5, 2.0, 2.5,…, 7.0}. Мы посчитали R
_sim ( d , θ), средняя доля избыточной последовательности по симуляциям.

Мы также выполнили моделирование, имитирующее предположение ACO, в котором семенные клоны были выбраны, как указано выше, но шаги ходьбы
затем произошло в предположении, что минимально перекрывающийся клон перекрывается ровно на 1/ d .Мы рассчитали R _{sim, ACO} ( d , θ), среднюю долю избыточного секвенирования по этим симуляциям.

Мы сравнили результаты моделирования с R
_{парковка} ( d , θ), избыточная последовательность при распределении парковок, предсказанная формулой в предложении 2. Разница Δ ( d , θ) = R
_{парковка} ( d , θ) — R
_sim ( d , θ) показан на Фигуре 12A.Разница незначительна (порядка с.э.м. из моделирования), за исключением малых d и малых θ. Несоответствие для малых d и θ можно легко увидеть из-за ACO, если исследовать разницу Δ ′ ( d, w ) = R
_{парковка} ( d , θ) — R
_{sim, ACO} ( d , θ), показанные на Фигуре 12B. Эта разница незначительна во всем диапазоне.

Рисунок 12.

Разница между формулами и симуляциями. На графиках показаны различия Δ между прогнозируемой долей избыточного секвенирования.
под парковочное распределение ( R
_{, парковка}) и доля избыточного секвенирования, наблюдаемая в ( A ) моделированиях, в которых клоны семян и ходячие клоны выбираются из случайно распределенной библиотеки ( R
_sim) и ( B ) моделирования, в которых исходные клоны выбираются из случайно распределенной библиотеки, но шаги ходьбы затем выполняются под
Предположение ACO ( R
_{сим, АСО}).Результаты показаны для различных значений , d, и θ. (■) d = 10; (⋄) д = 15; (○) d = 25; (▵) д = 50; (серый ▿) d = ∞.

Мы также изучили долю генома, охваченного после k шагов ( k = 1, 2,…, 10), сравнив прогноз при экспоненциальном распределении [предложение 1 (iii)] с результатами, представленными в
моделирования выше.В интересующем диапазоне прогнозируемая доля генома, покрываемого на каждой стадии, находилась в пределах 0,5% от предполагаемой.
результаты моделирования (не показаны). Наконец, мы смоделировали ситуацию с двумя библиотеками, в которых d, и θ были такими, как указано выше, а меньшая библиотека имеет глубину d ′ = 5. Опять же, разница Δ была чрезвычайно малой (не показано).

Таким образом, простые формулы, полученные в предположении AEO и ACO, достаточно близки для практических целей.Различия невелики и не влияют на основные выводы.

Заключение

Секвенирование генома ходьбой — это по своей сути последовательный процесс. Один засевает геном до начального покрытия π, а затем задействует
в последовательных обходах ходьбы.

Выполнение задачи в разумные сроки требует высокой степени параллелизма, то есть высокой плотности начального числа.
клоны, от которых ходят наружу в обоих направлениях. Количество таких шагов, покрывающих 90% генома, составляет
примерно равняется начальному среднему размеру океана [θ = (1 — π) / π], тогда как количество шагов для покрытия 98% примерно в два раза
такой же большой.

Существует очевидный компромисс между количеством шагов ходьбы и стоимостью дублирования последовательности. Как средний размер океана
θ увеличивается с 1 до 2 до 3, доля избыточного секвенирования уменьшается с 32% до 23% до 19%. (Эти значения соответствуют
в библиотеку с глубиной d = 15; они примерно на два процентных пункта ниже для библиотек с d = 25.)

Одним из решений является сокращение времени цикла, необходимого для каждого шага ходьбы, что делает возможным более последовательную ходьбу.
шаги в желаемые сроки.Поскольку время, необходимое для подготовки и проверки высококачественных библиотек для дробовиков, составляет
значительный компонент времени цикла, можно разработать эффективные и недорогие методы для подготовки библиотек для дробовиков
от всех клонов в библиотеке ВАС перед секвенированием. (Требования к хранилищу скромные, потому что каждая библиотека ружья
хранится в виде перевязочной смеси в одной пробирке до тех пор, пока не потребуется.)
шаг.Реализация такого подхода потребует значительной оптимизации или автоматизации существующих процедур подготовки.
библиотек для дробовика, но это возможно.

Дополнительным решением является использование второй библиотеки ВАС с меньшими клонами, примерно с половиной размера вставки. Этот подход
резко повышает эффективность. Для случаев, связанных с 15-кратной библиотекой, описанной выше, доля избыточного секвенирования
составляет 18%, 14% и 12%.Это намного ближе к наилучшему возможному результату, достигаемому с 15-кратной библиотекой ∼7,1% (= 1/14).
Важно отметить, что большая часть эффективности достигается при использовании второй библиотеки BAC, имеющей относительно небольшую глубину, для
Например, d ′ = 5.

Стратегию, конечно, можно обобщить. Можно использовать несколько библиотек BAC, каждая с разными размерами вставок, или одну
Библиотека ВАС с чрезвычайно разнообразными размерами вставок.Математический анализ таких стратегий был бы интересен, хотя
примечательно, что простая двухуровневая стратегия, описанная выше, уже устраняет большую часть избыточной избыточной последовательности.
из-за неэффективного закрытия океанов.

Следует отметить, что наш анализ игнорирует некоторые биологические и экспериментальные вопросы:

Пластины с переменным размером

Мы предположили, что библиотеки ВАС имеют вставки постоянного размера.Библиотека BAC с переменным размером вставки может быть больше
эффективнее, чем один с постоянным размером, потому что у него есть потенциал для оптимизации размера BAC, используемых для закрытия океанов.
Наша стратегия использования двух библиотек ВАС с постоянными вставками размером L и L ′ формально эквивалентна использованию одной библиотеки ВАС с переменным размером вставки, равным L или L ′. В принципе, библиотеки BAC с переменным размером вставки могут быть чрезвычайно эффективными: библиотека BAC с сильно изменяющейся вставкой
размер и бесконечная глубина позволят закрыть пробелы практически без потери последовательности.

На практике, однако, текущие библиотеки BAC имеют довольно узкое распределение по размерам, и поэтому эффект довольно скромный. В
человеческая библиотека RPCI-11, например, имеет размер вставки, который примерно нормально распределен со средним значением 160 kb и коэффициентом
вариации [(CV) определяется как отношение s.d.m.] несколько <10%.

Мы выполнили моделирование, чтобы сравнить долю избыточного секвенирования в двух случаях: (1) одна библиотека, имеющая
средний размер вставки 1 с размером вставки либо постоянным, либо нормально распределенным с CV = 10%, и (2) две библиотеки
со средними размерами пластин 1 и 0.5 с размерами пластин либо постоянными, либо нормально распределенными с CV = 10%. Как и ожидалось,
библиотеки переменных были немного более эффективными, чем библиотека констант. При θ = 1 абсолютная разница составила ∼4%.
в случае одной библиотеки ( d = 15) и 2% в случае двух библиотек ( d = 15, d ′ = 5). Для больших размеров океана θ абсолютные различия еще меньше. Короче говоря, эффекты довольно малы,
и основные выводы относительно ценности библиотеки, содержащей клоны меньшего размера, остаются в силе.

Интересный открытый вопрос — найти оптимальное распределение размеров вставок для библиотеки BAC заданной глубины.

Смещение клонирования

Мы предположили, что в геномной библиотеке нет систематической ошибки клонирования. Смещение клонирования, как известно, встречается во многих системах клонирования,
но природа и распространение систематической ошибки клонирования плохо изучены и, следовательно, их трудно смоделировать.Серьезная предвзятость при клонировании
против некоторых регионов, несомненно, приведет к более крупным первоначальным океанам, а также к меньшей эффективной глубине библиотеки в этих регионах.
Можно было бы предположить, что геном состоит из больших блоков с различным смещением клонирования.

Отсутствующие конечные последовательности

Мы предположили, что каждый ВАС был секвенирован на обоих концах.Текущие проекты секвенирования BAC-end иногда не могут создать
одна из конечных последовательностей из-за технических сбоев. Такие «несимметричные» BAC менее неэффективны, потому что можно выбрать
два таких клона, которые ходят по обе стороны океана и не знают (из-за отсутствия противоположной последовательности), что каждый
clone достаточно, чтобы закрыть океан самостоятельно. Воздействие проблемы можно оценить с помощью любого математического анализа.
или моделирование.Сама проблема может быть преодолена простым секвенированием дополнительных клонов ВАС для достижения желаемой глубины d в «двусторонних» клонах.

Повторяющиеся последовательности на концах ВАС

Мы предположили, что каждый ВАС имеет уникальную последовательность на обоих концах, что позволяет однозначно распознать перекрытие. Однако клон
конец может состоять полностью из повторяющейся последовательности, которую нельзя использовать для ходьбы.Если повторы относительно небольшие и достаточно
равномерно распределены по геному, проблема может быть решена просто путем конечного секвенирования большего количества BAC для получения
достаточное количество клонов с уникальной последовательностью на обоих концах (как в случае несимметричных BAC из-за технического сбоя). Если повторяется
неравномерно распределены по геному, проблема приведет к недопредставлению клонов в богатых повторами регионах
(как в случае смещения клонирования).Если будут иметь место очень длинные повторы, они предотвратят начало прогулки внутри повтора.
и может потребовать большего перекрытия. В общем, наиболее практичным решением является увеличение глубины библиотеки, используемой для
конечное секвенирование (см. также Siegel et al. 1998).

В этой статье основное внимание уделяется разработке простых моделей, позволяющих понять проблему секвенирования генома при ходьбе.
В реальном применении вы столкнетесь с такими сложностями, как те, что описаны выше.Лучшее решение — провести специализированное моделирование.
Однако результаты, представленные в этом документе, помогают определить ключевые проблемы и компромиссы и должны быть полезны при осмыслении того, как
разработать проект геномного секвенирования на основе клонов.

Благодарности

Мы благодарим Брюса Биррена и Кена Дьюара за полезные комментарии.С. был поддержан стипендией Merck / MIT. Эта работа была поддержана
частично за счет гранта Национальных институтов здравоохранения (E.S.L.).

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому эта статья должна быть настоящим
помечены как «реклама» в соответствии с разделом 1734 Кодекса США 18 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

Сноски

№5 Автор, ответственный за переписку.
E-MAIL lander {at} genome.wi.mit.edu; ФАКС (617) 252-1902.
- Поступила 22.07.1999 г.
- Принята к печати 29 октября 1999 г.
Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор

Геномный анализ

Картографическое или позиционное клонирование генов

Если вы определили маркеры, фланкирующие ваш ген, и определили
клон, в котором находятся маркеры, вы на пути к определению
где находится этот ген.Что вы собираетесь делать, это процедура
названный хромосомной ходьбой . Это включает в себя идентификацию клона
к которому находятся ваши маркеры и сопоставление сайтов STS на этом клоне в
ваше население. Если расстояние сцепления не улучшается, перейдите к
Сайты STS расположены на соседних клонах. Вы повторяете этот процесс до тех пор, пока
у вас есть маркеры, связанные с клоном, которые разделяются с вашим
ген. Это означает, что всякий раз, когда одна аллель вашего гена
выражены, маркеры, связанные с этим аллелем, также присутствуют, что
Это популяция не показывает рекомбинации.Чтобы ускорить
процесса клонирования, лучше всего иметь маркер, прочно связанный с
ген, с которым вы работаете. Поэтому у вас не будет
сделать много дополнительных проверок.

Поскольку ваш ген фланкирован на одном клоне между двумя маркерами,
теперь вы знаете, что ген должен находиться между этими двумя маркерами. Если клон
был секвенирован, вы ищите возможные гены в этом регионе. Ген
будет распознан путем поиска открытых рамок считывания (ORF) , последовательностей
который, скорее всего, будет кодировать генный продукт.В лучшем случае
обнаруживается только одна ORF, но это часто не так. Как правило
найдено несколько возможных ORF.

Что делать дальше, зависит от вашего вида. Для растений прямой
доказательство возможно. Ген-кандидат вводится в генотип, который
является мутантом по гену, полученным методом генной инженерии, под названием растение
Трансформация . Трансгенное растение (продукт трансформации растений)
анализируется, и если введенный ген придает фенотип дикого типа
тогда вы знаете, что клонировали ген.

Для таких видов, как человек, развитие трансгенных животных невозможно.
Поэтому требуется мутационный анализ. Библиотека сделана
лиц, экспрессирующих мутировавший ген. ORF используются как
зонды для выбора комплементарных последовательностей из библиотеки, содержащей мутант
ДНК. Затем ORF секвенируют и сравнивают с ORF из
нормальная библиотека ДНК. Эта ORF из мутантной библиотеки, которая
отличный от своего аналога в обычной библиотеке — сильный кандидат
для гена.Исследования экспрессии должны быть выполнены для дальнейшего подтверждения
заключение. То есть клон должен гибридизоваться с мРНК в тканях в
который экспрессируется геном, и он должен показывать другую картину
выражения. Опять же, это простой сценарий. Как ты
Можете себе представить, может потребоваться гораздо более сложный анализ, чтобы подтвердить, что
был клонирован ген.

Трости Остановка, падение и клонирование, чтобы выжить

К счастью, необычные насекомые, обитающие на всех континентах, кроме Антарктиды, легко доступны в качестве субъектов.

Эдвард Рамирес, студент-исследователь из Калифорнийского университета в Беркли, в настоящее время изучает генетику индийских тростей. (Джош Кэссиди / KQED)

«Это очень распространенный инвазивный вид, который можно найти по всей Калифорнии, в том числе прямо здесь, в университетском городке», — сказал Рамирес. «Все наши образцы, которые мы изучаем, были собраны, когда они были вне дома. ночью у ближайшего ручья, так как они ведут ночной образ жизни ».

Цвета — важная часть камуфляжной защиты палочников.Когда эти палочники вылупляются впервые, они коричневые. По мере созревания и последующей линьки они могут менять цвет на ряд ярких — от светло-зеленого до гораздо более темного коричневого.

Большое разнообразие цветов индийских тростей остается загадкой для исследователей. (Аарон Померанц / KQED)

«Наличие взрослых особей разной окраски позволяет им занимать и лучше выживать в разных частях растения», — сказал Рамирес. ствол дерева или более темные стебли плюща и ежевики.С другой стороны, более светлые зеленые палочники имеют преимущество на более зеленых поверхностях, таких как нижняя часть листьев или более зеленые стебли растений ».

Эти различия в цвете также влияют на то, насколько хорошо они могут ускользать от хищников. Более темное насекомое-палочка может использовать другое средство защиты — поведенческую мимикрию — если оно чувствует угрозу. Как только он сложит конечности, он упадет на землю и «станет похож на мертвую ветку», — сказал Рамирес.

Одна загадка, которую пытается разгадать Рамирес, — это то, почему существует такая красочная палитра индийских тростей.Они партеногенны, а это значит, что самкам не нужны самцы для воспроизводства. Они действительно могут клонировать себя.

Зеленая индийская трость сливается с зеленым фоном. (Джош Кэссиди / KQED)

«Поэтому очень интересно увидеть большое разнообразие разных цветов у палочников, потому что если они клоны матери, они все должны быть одинаковыми, но это не так, » он сказал.

«Это действительно интересно исследовать и определенно потребует дополнительного генетического анализа, которого мы еще не сделали.Но, надеюсь, когда-нибудь это станет возможным в будущем », — добавил он.

Одна из причин может быть связана с генетическими мутациями.

«Есть много других видов, которые подвергаются партеногенезу, такие как тли, виды пчел, муравьев, ос, мух и другие, которые проходят через аналогичные механизмы бесполого клонирования и могут иметь мутации», — сказал Рамирес. «Однако эти насекомые содержат очень мало или не имеют каких-либо заметных изменений цвета по сравнению с индийскими палочниками».

Рамирес сказал, что надеется использовать инструмент редактирования генов CRISPR / Cas9, чтобы попытаться раскрыть тайны индийской трости.

Он также планирует поступить в стоматологическую школу после окончания в этом году, чтобы использовать свои знания, полученные при изучении трости. Его опыт в области генетики и редактирования генов поможет ему в новых областях исследований, таких как биоинженерия зубов человека с использованием стволовых клеток.

«Это было бы революционным для стоматологии, поскольку пациенты, потерявшие постоянные зубы, могли бы их заменить», — сказал Рамирес.

Игроки в Walking Simulator любят клона Death Stranding: «Мне нравится часть, где вы идете»

Нет необходимости ждать Death Stranding на ПК, чтобы поиграть в игру о том, как таскать тяжелые предметы и падать.

Пользователи Steam требуют загрузить Walking Simulator , бесплатное любовное письмо и / или обвинительный акт в отношении последнего творения Kojima Productions. Пока он все еще находится в стадии бета-тестирования, вы уже можете пройти серию миссий, которые заставят вас бродить по постапокалиптической Антарктиде для доставки. Говорят, это все равно постапокалипсис, в основном это просто Антарктида.

Как и в Death Stranding, вы начинаете с того, что привязываете предметы к спине и продвигаетесь по миру пешком.В конце концов вы набираете достаточно лайков, чтобы покупать удобные транспортные средства, такие как реактивный ранец или грузовик с платформой. Здесь нет ничего из этого жалкого создания инфраструктуры: вы будете вести этот грузовик прямо через антарктические ледяные поля, как седой грузовик, которым вы были рождены.

Еще вы будете падать и много тряпаться. Но хватит моей оценки, вот несколько ярких отзывов от сообщества Steam:

«10/10 ‘Просто потрясающе’ — Хидео Кодзима» — Mtropele

«Мне нравится часть, где вы идете.»- MaybeYaBoi

» неплохая замена death stranding, если предположить, что death stranding такая же, просто стоит на 40-70 долларов больше, чем это «- Bad Time Tim

В одном из редких отрицательных отзывов о Walking Simulator , недовольный игрок указал на одну из несоответствий, лежащих в основе игры.

«вы можете запустить» — Мияги

Я могу утверждать, что, как и Kojima Productions, добавившая размещение продукта в Death Stranding в качестве комментария к Культурное влияние брендов расширилось и в постапокалипсис, разработчик Pugscape включил возможность запуска в Walking Simulator как отражение того, как быстро мы жертвуем своими идеалами на алтарь удобства.Я просто все это выдумал, но звучит правильно.

Дата выхода ПК Death Stranding отложена, поэтому у вас будет дополнительное время, чтобы побродить по Антарктиде в Walking Simulator.

убийств в «Ходячих мертвецах», «Войны клонов» окончены и 21 шоу другого жанра

У нас было много шоу на этой неделе, но казалось, что все смотрят сериал The Walking Dead . В финале второго сезона сериал снова вошел в книгу рекордов рейтингов, полностью доминируя в воскресенье вечером.

Между тем, The Clone Wars завершили свой четвертый сезон на высокой ноте, а The River , Alcatraz и Awake продолжают борьбу.

Ознакомьтесь с нашим графиком и комментариями, чтобы узнать больше о том, как ваши любимые шоу идут в зрителях Live + Same Day и в рейтингах.

ПОНЕДЕЛЬНИК

Алькатрас (FOX) 5,07 миллиона зрителей / 1,6 / 4 акции

Всего за две недели до финала сезона дела Alcatraz по-прежнему выглядят мрачно.На этой неделе шоу снизилось еще на полмиллиона зрителей и упало на три десятых пункта рейтинга и, вдобавок, на один пункт рейтинга. Таким образом, у него 5 миллионов зрителей, 1,7 рейтинговых балла и четыре балла по сравнению с премьерой сериала всего два месяца назад. Вполне возможно, что финал сезона 26 марта также может стать финалом сериала.

Быть человеком (Syfy) 1,36 миллиона зрителей / 0,6

Быть человеком упал на десятую часть рейтинга, но на этой неделе стал равным по количеству зрителей.Он продолжает уверенный второй сезон на Syfy.

Lost Girl (Syfy) 1,19 миллиона зрителей / 0,4

Lost Girl также потерял десятую часть балла на этой неделе, но сохранил большую часть своих зрителей. У него также стабильный, но не звездный сезон.

Terra Nova (FOX) — ОТМЕНЕН

Terra Nova закончили в Fox, но, возможно, еще не закончили. Мы будем держать вас в курсе.

ВТОРНИК

The River (ABC) 4,09 миллиона зрителей / 1.3/4 доли

После небольшого всплеска на пятой неделе в эфире, The River снова опустился на шестое место, потеряв чуть более 200 000 зрителей и две десятых рейтинга. В сезоне осталась всего одна серия, и будущее этого шоу выглядит не очень хорошо. Но он еще не умер, так что, если вы фанат, продолжайте смотреть.

СРЕДА

Американская история ужасов (FX) — СДЕЛАНО ДЛЯ СЕЗОНА

Не беспокойтесь о Американской истории ужасов .Второй сезон уже в пути, и все, что нам нужно сделать, это подождать.

Touch (FOX) —OFF

Touch не транслировал ни одного нового эпизода с январской премьеры, но этот эпизод вернулся в специальном повторном эфире в четверг. Этот эфир собрал 8,57 миллиона зрителей, рейтинг 2,2 и шесть долей, заняв второе место по количеству зрителей и третье место по рейтингу в своем временном интервале. Трансляция была на 3,5 миллиона человек меньше, чем в первом эфире в январе, но это могло быть связано с тем, что не все чувствовали необходимость посмотреть ее во второй раз.Вторая серия наконец выйдет в эфир в этот четверг в 21:00. Eastern, а затем мы, наконец, начнем прояснять большой вопросительный знак в расписании Fox, а именно Touch .

ЧЕТВЕРГ

Теория большого взрыва (CBS) —OFF

March Madness вытеснило The Big Bang Theory из эфира на пару недель. Новые серии возвращаются 29 марта.

Интересующее лицо (CBS) —OFF

Интересующее лицо также уходит, чтобы уступить место баскетболу.Новые серии 29 марта.

Дневники вампира (CW) 2,64 миллиона зрителей / 1,2 / 4 публикации

Дневники вампира вернулся в четверг после трехнедельного отсутствия с твердыми, но не звездными цифрами. Это более 200000 зрителей и две десятых пункта рейтинга ниже, чем было, когда он ушел, но по мере того, как шоу приближается к заключительным эпизодам сезона, мы, вероятно, можем ожидать всплеска.

The Secret Circle (CW) 1,62 миллиона зрителей / 0,7 / 2 публикации

Тайный круг также вернулся после трехнедельного перерыва на этой неделе и сумел выйти на уровень безубыточности в своих рейтингах, хотя и потерял несколько зрителей.Могут ли последние эпизоды сезона, наконец, подтолкнуть шоу к отметке в 2 миллиона? Посмотрим и увидим.

Awake (NBC) 5,12 миллиона зрителей / 1,6 / 4 доли

Awake привлек еще несколько зрителей за третью неделю в эфире, но вышел на уровень даже в этих важнейших рейтингах и общих оценках. Шоу изо всех сил пытается найти свое место по вечерам в четверг, где обычно правит CBS, но пока не считайте это. Еще есть время наверстать упущенное.

ПЯТНИЦА

Одаренный мужчина (CBS) — СДЕЛАНО ДЛЯ СЕЗОНА

«Одаренный человек» готовится в течение года, и широкие слухи о том, что он будет отменен, до сих пор не подтверждены или опровергнуты CBS. Поклонникам остается только подождать.

Чак (NBC) — СЕРИЯ ЗАКОНЧИЛАСЬ

Чак подписался в последний раз, и мы его пропустим. Это была не очень рейтинговая программа, но, черт возьми, это было весело.

Бахрома (FOX) —OFF

Fringe снова был отключен в прошлую пятницу.На этой неделе выходит новый эпизод.

Гримм (NBC) —ПОВТОР

Grimm не работал на этой неделе. Новые серии возвращаются 30 марта.

Сверхъестественное (CW) 1,73 миллиона зрителей / 0,7 / 2 доли

Сверхъестественное вернулся на прошлой неделе вместе с другими жанровыми шоу The CW. У него даже не было зрителей, но он упал на одну десятую рейтинга. Тем не менее, эти цифры довольно солидны для этого шоу, так что реальной опасности здесь нет.

Войны клонов (TOON) 2.02 миллиона зрителей / 0,5

Войны клонов привлекло внимание зрителей к финалу сезона в пятницу вечером. Возвращение Дарта Мола помогло сделать финал третьей по популярности серией сезона. Мы снова увидим это шоу осенью в пятом сезоне.

Святилище (Syfy) — СДЕЛАНО ДЛЯ СЕЗОНА

Мы все еще не знаем, увидим ли мы пятый год для Sanctuary , но ему удалось закончить свой четвертый год с небольшим скачком числа.А пока оставим хорошие новости.

Мерлин (Syfy) 1,44 миллиона зрителей / 0,4

Мерлин получил самую низкую посещаемость в четвертом сезоне (в США) в пятницу, в сезоне осталось всего два эпизода. Но, учитывая, что финал сезона состоит из двух частей, ожидайте больших чисел до того, как шоу закончит свой год.

Спартак: Месть (Starz) 1,1 миллиона зрителей / 0,5

Spartacus также достиг минимального сезона в пятницу вечером, и он тоже подходит к концу (да, уже).Однако, если повезет, финал сезона будет выглядеть лучше.

ВОСКРЕСЕНЬЕ

Ходячие мертвецы (AMC) 8,99 миллиона зрителей / 4,7

На прошлой неделе мы задавались вопросом, сможет ли The Walking Dead превзойти рекордные рейтинги, премьера которых состоялась в середине сезона в феврале. Оказывается, он побил не только эти рекорды. Он разнес их на части, как выстрел из дробовика в череп зомби. Финал второго сезона «Рядом с умирающим огнем» теперь стал самой популярной базовой кабельной драмой в истории в ключевых демонстрациях.Он собрал почти на 1 миллион зрителей больше, чем премьера в середине сезона, и набрал пол-балла в рейтинге.

Эти 4,7 балла полностью разрушили шоу, которое шло вторым по телеграфу в воскресенье вечером, которое как раз оказалось сопутствующей программой Walking Dead , Talking Dead (ему удалось получить 2,3). Если сложить количество просмотров как премьеры, так и повтора через полтора часа, в воскресенье вечером эту серию посмотрели 10,5 миллиона человек. И доминирование не только в кабельном телевидении.Шоу с самым высоким рейтингом в воскресенье вечером набрало 2,9 балла, что означает, что Ходячие мертвецы были самой популярной программой на телевидении в воскресенье. Отличная работа, AMC. Теперь вы должны попытаться превзойти это с помощью третьего сезона.

Once Upon a Time (ABC) 8,69 миллиона зрителей / 2,9 / 8 акций

Ничто не могло превзойти Ходячие мертвецы Воскресная ночь, но Однажды в сказке все еще была довольно хорошей неделей. Она потеряла около 600 000 зрителей, но вышла на уровень безубыточности по рейтингу и доле и осталась главной драматической трансляцией вечера.

Генетически модифицированные люди ходят среди нас

Казалось, что человечество перешло важную черту: в Китае ученый по имени Хэ Цзянькуй объявил в понедельник, что в ноябре родились близнецы с геном, который он отредактировал, когда они были эмбрионы.

Но в некотором смысле эта новость вовсе не нова. Среди нас уже ходят несколько генетически модифицированных людей.

В середине 1990-х годов доктора репродуктологии в Нью-Джерси придумали, как помочь женщинам иметь детей.Они подозревали, что некоторые женщины изо всех сил пытались забеременеть из-за дефектного материала в их яйцеклетках.

Чтобы омолодить их, врачи удалили часть желеобразной начинки из яйцеклеток, подаренных здоровыми женщинами, и ввели ее в яйцеклетки своих пациентов перед проведением экстракорпорального оплодотворения.

Исследователи не спрашивали у Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов разрешение опробовать эту процедуру. Только после того, как их пациенты стали рожать здоровых детей, они поделились новостью о том, что это, похоже, работает.Как только это стало известно, потенциальные родители устремились в клиники, чтобы сами опробовать эту процедуру.

Но другие люди отреагировали скорее шоком, чем возбуждением. Наши клетки производят топливо на миниатюрных фабриках, называемых митохондриями. И каждая митохондрия несет свой небольшой набор генов. Врачи из Нью-Джерси могли создать детей на основе ДНК трех человек, а не двух.

Оказалось, что это действительно так. Врачи обнаружили, что у некоторых детей помимо родителей была митохондриальная ДНК доноров.В своем отчете 2001 года об этом открытии они назвали это «первым случаем генетической модификации зародышевой линии человека, результатом которой стали нормальные здоровые дети». Зародышевая линия — это линия клеток, которая дает начало новому человеку.

The F.D.A. не был доволен. Он разослал в клиники письма с требованием подать заявку на тестирование метода, как если бы это был новый экспериментальный препарат. Эти бюрократические препоны были настолько серьезными, что в клиниках перестали вводить яйца.

К тому времени, возможно, родилась дюжина детей со смесью ДНК.Может, их больше — точно никто не знает.

Позднее врачи из Нью-Джерси разыскали некоторых из этих детей и не обнаружили ничего необычного в их здоровье в подростковом возрасте. Тем временем некоторые биологи поняли, что изменение их процедуры может помочь в другом: предотвратить болезни, которые в противном случае неизлечимы.

Подобно ДНК в наших хромосомах, ДНК в наших митохондриях может мутировать. Мутации могут вызывать симптомы, варьирующиеся от слепоты до ранней смерти, и женщины передают их своим детям.По оценкам, каждый 5000 человек страдает митохондриальным заболеванием, и для подавляющего большинства нет эффективных методов лечения. Ученые задались вопросом, могут ли они стереть эти болезни, заменив митохондрии.

Процедура, которую они придумали, началась с извлечения хромосом пациентки из одного из ее яйцеклеток. Затем они получили яйцеклетку от здорового донора и удалили ее хромосомы. Наконец, они вставили хромосомы пациента в донорскую яйцеклетку и оплодотворили ее спермой.

Испытания этой так называемой митохондриальной заместительной терапии, проведенные на мышах и обезьянах, дали обнадеживающие результаты.Но когда ученые обратились к правительству Соединенных Штатов с просьбой опробовать его на человеческих яйцах, их закрыли.

Людей беспокоили не только возможные медицинские риски. Многие сочли это оскорблением человеческого достоинства.

«Это жуткая форма евгенического клонирования человека», — заявил конгрессмен из Небраски Джефф Фортенберри на слушаниях в 2014 году.

Два года спустя в законопроект о бюджете Конгресса загадочным образом было внесено положение, запрещающее F.D.A. даже от рассмотрения вопроса о заместительной митохондриальной терапии.Итак, исследователи ушли в подполье.

В 2016 году американский врач по лечению бесплодия по имени Джон Чжан объявил, что он отправился в Мексику, чтобы незаметно провести операцию на женщине из Иордании с неврологическим заболеванием под названием синдром Ли. Она родила мальчика, который оказался здоровым. Но она и ее муж не были заинтересованы в том, чтобы позволить ученым следить за здоровьем их ребенка. Нам больше ничего не известно о его судьбе.

Эта история громко отозвалась на этой неделе, когда доктор Хе, доцент Южного университета науки и технологий в Шэньчжэне, сказал миру, что он создал генно-отредактированных младенцев, изменив ДНК человеческих эмбрионов с помощью новой технологии. называется Криспр.

Он вырезал небольшую часть ДНК из гена CCR5. Люди, у которых отсутствует этот кусок генетического материала, по-видимому, устойчивы к инфекциям, вызываемым вирусом иммунодефицита человека. Доктор Хе рассуждал, что генетически модифицированные младенцы тоже будут сопротивляться вирусу.

В воскресенье MIT Technology Review опубликовала эту новость, за которой последовал пространный рассказ Associated Press. Доктор Хе опубликовал серию победных видеороликов в Интернете, а в среду он отправился на крупную конференцию по редактированию генов в Гонконге, чтобы показать слайды с некоторыми деталями своей работы .

Как и врачи из Нью-Джерси до него, доктора Хэ резко осудили за скрытное безрассудство. Организаторы встречи в Гонконге в четверг выступили с заявлением, в котором назвали рождение близнецов «безответственным». Они сказали, что доктор Хэ плохо разработал исследование, и назвали его этические соображения «неудачными». Некоторые ученые, наблюдавшие за выступлением доктора Хе, задавались вопросом, мог ли он на самом деле удалить не тот кусок гена CCR5. Китайское правительство назвало процедуру незаконной и начало расследование.

Я связался с Гленном Коэном, профессором Гарвардской школы права, изучающим репродуктивные технологии, и попросил его угадать, что будет дальше. Его прогноз звучал как повторение истории замены митохондрий.

«Я чувствую, что произойдет то, что во всем мире будут жесткие регулирующие меры», — сказал мне профессор Коэн. Он предсказал полный запрет технологии. «Люди напуганы, и когда они напуганы, они принимают не столь тонкие решения.

В среду комиссар FDA Скотт Готлиб, похоже, поверил предсказанию профессора Коэна. В интервью BioCentury он раскритиковал научное сообщество за то, что оно не смогло остановить доктора Хи, и предупредил о «потенциальных правилах и законах, которые могут быть гораздо более строгими, чем они могли бы быть в противном случае, если бы было больше уверенности в том, что сообщество способно к самоуправлению». вводить соответствующие стандарты ».

Было бы обидно. Бывают случаи, когда редактирование человеческих эмбрионов имело бы медицинский смысл.В прошлом году Национальная академия наук и Национальная медицинская академия выпустили подробные инструкции о том, какие случаи могут быть квалифицированы. Хотя они не указали на какое-либо конкретное заболевание, они утверждали, что его следует рассматривать только тогда, когда никакое другое лечение не может позволить родителям иметь здорового ребенка.

К счастью, история предлагает нам другой путь. Достаточно посмотреть, что случилось с заместительной митохондриальной терапией в Великобритании.

Когда британские ученые подняли идею использования этой процедуры на человеческих яйцах, в стране велся серьезный, открытый разговор о плюсах и минусах.

Клон когда идет: «Клон» — когда смотреть по ТВ — Яндекс.Телепрограмма

Клон — Сериалы — Телеканал Ю

телеканал «Ю», премьера, сериал, фильм, анонс, дата, фото, видео, актеры, режиссер, сценарий, подробности

почему к новой соцсети Twibe сразу возникло много вопросов – МБХ медиа

Тендер 0102200001620002494: Поставка расходных материалов и изделий медицинского назначения

Партия Зеленского обратилась в МВД из-за «кандидатов-клонов» :: Политика :: РБК

Nissan Tiida – мексиканский клон Megane идет в Россию :: Autonews

git clone fail : речь идет о настройке сертификата

2 ответа

Похожие вопросы:

Chromosome Walking — обзор

2. 74EF

Секвенирование генома путем ходьбы с последовательностями на конце клона: математический анализ

Абстрактные

Базовая модель

Библиотека BAC

Секвенирование

Математический анализ

Предложение 1

Проба

Предложение 2

Проба

Результаты

Использование меньших клонов для закрытия пробелов

Предложение 3

Проба

Оптимизация глубины библиотеки BAC

Посев генома

Одновременный посев

Посев на основе контигов

Симуляторы

Заключение

Пластины с переменным размером

Смещение клонирования

Отсутствующие конечные последовательности

Повторяющиеся последовательности на концах ВАС

Благодарности

Сноски

Геномный анализ

Картографическое или позиционное клонирование генов

Трости Остановка, падение и клонирование, чтобы выжить

Игроки в Walking Simulator любят клона Death Stranding: «Мне нравится часть, где вы идете»

убийств в «Ходячих мертвецах», «Войны клонов» окончены и 21 шоу другого жанра

ПОНЕДЕЛЬНИК

Алькатрас (FOX) 5,07 миллиона зрителей / 1,6 / 4 акции

Быть человеком (Syfy) 1,36 миллиона зрителей / 0,6

Lost Girl (Syfy) 1,19 миллиона зрителей / 0,4

Terra Nova (FOX) — ОТМЕНЕН

ВТОРНИК

The River (ABC) 4,09 миллиона зрителей / 1.3/4 доли

СРЕДА

Американская история ужасов (FX) — СДЕЛАНО ДЛЯ СЕЗОНА

Touch (FOX) —OFF

ЧЕТВЕРГ

Теория большого взрыва (CBS) —OFF

Интересующее лицо (CBS) —OFF

Дневники вампира (CW) 2,64 миллиона зрителей / 1,2 / 4 публикации

The Secret Circle (CW) 1,62 миллиона зрителей / 0,7 / 2 публикации

Awake (NBC) 5,12 миллиона зрителей / 1,6 / 4 доли

ПЯТНИЦА

Одаренный мужчина (CBS) — СДЕЛАНО ДЛЯ СЕЗОНА

Чак ​​(NBC) — СЕРИЯ ЗАКОНЧИЛАСЬ

Бахрома (FOX) —OFF

Гримм (NBC) —ПОВТОР

Сверхъестественное (CW) 1,73 миллиона зрителей / 0,7 / 2 доли

Войны клонов (TOON) 2.02 миллиона зрителей / 0,5

Святилище (Syfy) — СДЕЛАНО ДЛЯ СЕЗОНА

Мерлин (Syfy) 1,44 миллиона зрителей / 0,4

Спартак: Месть (Starz) 1,1 миллиона зрителей / 0,5

ВОСКРЕСЕНЬЕ

Ходячие мертвецы (AMC) 8,99 миллиона зрителей / 4,7

Once Upon a Time (ABC) 8,69 миллиона зрителей / 2,9 / 8 акций

Генетически модифицированные люди ходят среди нас

Добавить комментарий Отменить ответ

Чак (NBC) — СЕРИЯ ЗАКОНЧИЛАСЬ